西洋参愈伤组织悬浮培养物细胞分化与皂苷合成关系的研究

研究了西洋参愈伤组织悬浮培养物细胞生长曲线 ,观察了细胞形态结构和组织化学变化。结果表明 ,在延滞期愈伤组织细胞无分化 ,皂苷含量低 ;对数生长期细胞刚刚开始分化 ,皂苷开始积累 ;到直线生长期 ,培养物细胞导形成较多 ,皂苷大量积累 ;到静止期 ,皂苷积累达到高峰 ,此时用高效液相色谱法测定培养物 ,皂苷含量为 3.2 0 8% ,Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2 、Rd含量分别为 0 .0 2 %、0 .2 8%、1 .1 6%、0 .1 6%、0 .1 6%和 0 .2 2 % ,说明西洋参皂苷合成与细胞分化呈正相关。

石柱参人参皂苷合成酶基因SS的克隆与序列分析

以石柱参近缘种野生山参的人参皂苷合成酶基因SS为模板,利用NCBI中的primer-BLAST设计特异性引物,应用PCR技术从石柱参叶片基因组DNA克隆了SS基因。序列分析显示,克隆的基因片段为1285 bp,能够编码25个氨基酸以上的ORF(Open Reading Frame)有10个,其中最长能够编码295个氨基酸。NCBI序列对比显示,该基因与人参的人参皂苷合成酶基因SS的同源性为97.05%,与西洋参的人参皂苷合成酶基因SS的同源性为96.63%。这些数据表明,从石柱参克隆的基因为其人参皂苷合成酶基因SS。

芦笋不同采收模式下产量、皂苷含量及皂苷合成基因HMGS,FPPS和SS表达研究

为研究不同采收模式对芦笋产量、皂苷量及其皂合成基因表达的影响,通过对弥勒三年生芦笋(泽西骑士),进行白芦笋、光头绿芦笋、留母茎绿芦笋3种芦笋采收方式的小区试验,测定小区产量并收集芦笋样品;测定样品中总皂苷及薯蓣皂苷元的含量;设计引物,RT-PCR克隆皂苷合成中的羟甲基戊二酰辅酶A合酶(Ao HMGS)、发尼烯合酶(Ao FPPS)和沙烯合酶(Ao SS)全长编码序列,并检测这些基因在不同采收模式和不同部位的表达。结果表明:相对于白芦笋,光头采绿芦笋与留母茎采绿芦笋获得较高产量,后者采收芦笋含有最高总皂苷与薯蓣皂苷元。q-RT-PCR分析表明:不同采收模式芦笋Ao HMGS、Ao FPPS和Ao SS的表达与总皂苷及薯蓣皂苷元的含量呈明显负相关,而同一模式、同一嫩茎不同部位间并不存在相关关系,其可能与留母茎采收过程中,母茎中合成薯蓣皂苷元及总皂苷能部分转运至商品笋中有关。该研究确定留母茎芦笋采收具有较好的皂苷含量,是值得推广的生产模式。

转录组和代谢组联合分析揭示大叶黄精皂苷生物合成相关酶基因

为了丰富大叶黄精(Polygonatum kingianum var.grandifolium)根茎发育的转录组数据,发掘参与皂苷生物合成的功能基因,基于Illumina深度测序平台,对大叶黄精根茎进行转录组测序,并对次生代谢途径中皂苷的生物合成通路进行深入解析。结果显示,大叶黄精根茎的转录组数据经拼接后获得198296条转录本、92858条基因序列。基于超高效液相色谱和串联质谱(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)检测平台和自建数据库共检测到238种差异显著代谢物。根据大叶黄精皂苷合成途径中酶基因注释和差异基因的表达及代谢途径富集的分析,一共找到3条合成皂苷途径的相关通路以及33个酶基因,推测这些酶基因在皂苷合成途径中起关键作用。该研究为大叶黄精的转录组学和代谢组学研究提供了丰富的参考数据,对于大叶黄精的功能基因组学研究具有重要意义。

茉莉酸甲酯调控下人参发状根皂苷合成相关基因表达的研究

通过外源添加茉莉酸甲酯(MeJA),研究其调控液体培养条件下人参发状根中皂苷生物合成途径相关酶基因在诱导子作用时表达情况。以四年生吉林人参主根诱导的人参发状根无性系为材料,利用香草醛-硫酸比色法测定MeJA处理前后人参发状根的总皂苷含量;同时,利用荧光实时定量PCR测定MeJA处理前后人参发状根中鲨烯合成酶(squalene synthase,SQS)、鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SQE)、氧化鲨烯环化酶(oxidized squalene cyclase,OSC)、达玛烷二醇合成酶(dammarenediol synthase,DS)、β-香树脂合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)和环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的相对表达量。结果表明:获得MeJA添加到人参发状根中最佳添加浓度为6×10^(-4)μmol·L^(-1)、添加时间为22 d、作用时间为5 d;MeJA的添加可以提高人参发状根中过氧化物酶(PPD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(PPD)的酶活性;经过MeJA处理后人参发状根中人参皂苷生物合成途径的SQS,SQE,OSC,DS,β-AS基因的表达变化均有显著提高,然而CAS基因的表达变化不显著。因此说明在添加MeJA处理后,皂苷生物合成途径中SQS,SQE,OSC,DS,β-AS基因表达情况与PPD,CAT,PPO的酶活性的变化趋势也相一致。

盾叶薯蓣悬浮培养细胞生长及薯蓣皂苷元合成

研究了盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中细胞生长、薯蓣皂苷元合成、蔗糖和磷酸盐的吸收利用以及酸性磷酸酶活性与薯蓣皂苷元合成的关系。结果表明,对数生长期细胞最大比生长速率μm为0.19 d-1;倍增时间为3.68 d;薯蓣皂苷元的形成与细胞的生长相关,培养6 d时薯蓣皂苷元质量分数和产量分别为0.20%和25.93 mg/L;蔗糖利用率达到95.65%,磷酸盐吸收率达到最大,为90.36%。盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中酸性磷酸酶活性动态变化规律与薯蓣皂苷元的动态合成规律基本一致。此外,研究还发现在相同供磷水平下,酸性磷酸酶活性高低与薯蓣皂苷元合成能力呈正相关;而在不同供磷水平下,酸性磷酸酶活性高低与薯蓣皂苷元合成能力没有相关性。

人参皂苷生物合成相关新基因GBR6的cDNA克隆及序列分析

从人参根组织中分离总RNA,使用RT-PCR扩增出人参皂苷生物合成相关基因GBR6开放阅读框(ORF)cDNA片断,并将其定向克隆入原核高效表达载体pQE30,阳性克隆经BamHⅠ和PstⅠ双酶切鉴定、测序验证与已知的GBR6ORF序列完全一致.因而成功构建了pQE30-GBR6ORF融合原核表达载体,为下一步进行GBR6功能表达分析奠定了基础.

岗梅全长转录组测序及其三萜皂苷生物合成相关基因的挖掘

目的:获得岗梅全长转录组数据库,为深入挖掘岗梅功能基因奠定基础。方法:采用基于PacBio Sequel平台的单分子实时测序技术获取岗梅的根、茎、叶样品的转录组数据,并利用非冗余蛋白(NR)、核苷酸序列(NT)、SwissProt蛋白序列数据库、京都基因与基因组百科全书(KEGG)、真核生物相邻类的聚簇(KOG)、蛋白家族(Pfam)、基因本体(GO)进行注释,分析并鉴定编码三萜皂苷生物合成的关键酶的转录本。结果:全长转录组共获得89629个转录本,其中81313个在公共数据库进行了注释。KEEG代谢通路富集分析表明,623个转录本参与岗梅中三萜皂苷合成相关的3条代谢通路,其中263个转录本编码了三萜皂苷生物合成途径的21个关键酶。此外,还预测了2471个转录因子、40421个简单重复序列位点、22119个长链非编码RNA(lncRNA)和29131个mRNA。结论:丰富了岗梅的转录组数据,并为鉴定参与三萜皂苷和其他次生代谢物生物合成的候选基因提供参考,促进其分子生物学和基因组学的研究。

人参皂苷次生代谢产物的合成研究

目的:在体外对人参皂苷Compound K的次生代谢产物棕榈酸酯(PM1)进行合成研究。方法:运用化学方法进行合成实验,使用硅胶柱色谱及高效液相色谱等方法进行分离,得到棕榈酸酯(PM1)。结果:鉴定了棕榈酸酯(PM1)的化学结构,同时利用液相色谱测定了其转化率。结论:首次在体外合成了人参皂苷Compound K的次生代谢产物棕榈酸酯(PM1),合成产物平均转化率为27.59%。

人参15个组织器官中皂苷量与6种人参皂苷生物合成基因表达的相关性研究

以四年生红果期吉林人参的15个组织器官为材料,利用HPLC和香草醛-硫酸比色法分别测定15个组织器官中6种单体皂苷(人参皂苷Rg1,Re,Rb1,Rc,Rb2,Rd)和总皂苷含量;同时,利用实时荧光定量PCR测定15个组织器官中法尼基焦磷酸合成酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)、鲨烯合成酶(squalene synthase,SQS)、鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SQE)、氧化鲨烯环化酶(oxidized squalene cyclase,OSC)、β-香树脂合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)和细胞色素P450超家族(cytochrome P450 family,P450)基因的相对表达量。研究试图通过相关性分析,获得吉林人参15个组织器官中人参皂苷含量与生物合成途径相关酶基因表达量之间相关关系。结果表明,6种单体皂苷含量之间具有线性正相关的协同增减趋势,而单体皂苷含量与总皂苷含量之间具有相关性极显著(P<0.01)的正相关关系;总皂苷含量与人参中SQS,OSC,β-AS,SQE,P450,FPS基因之间的相关性极显著(P<0.01),单体皂苷含量与6种酶基因之间相关性各不相同。说明这6种参与人参皂苷生物合成酶基因调控人参总皂苷与单体皂苷的生物合成,它们在人参不同组织器官中的表达呈现协同增减趋势,并以集群协调表达的方式来调控人参皂苷生物合成。

人参皂苷生物合成基因组织表达特性的研究

采用生物信息学及实时荧光定量方法对10个人参皂苷生物合成关键酶基因的组织表达特性进行研究。运用转录组热图聚类方法分析了四年生吉林人参14个不同部位人参皂苷生物合成基因的表达;运用实时荧光定量PCR的方法测定人参组培苗、不定根中人参皂苷生物合成基因的表达;运用Pearson相关对这10个人参皂苷生物合成关键酶基因表达特性进行分析。结果表明,β-AS,CYP716A52v2在吉林人参及组培苗的根中表达高,与Ro分布相一致;与达玛烷型人参皂苷合成相关的CYP716A47,CYP716A53v2表达呈显著正相关,从分子水平证明了人参皂苷化学成分分布的差异主要由转运引起。

西洋参不同组织部位中皂苷生物合成相关基因的表达研究

通过皂苷含量与基因表达量之间相关性分析,获得西洋参中不同组织部位皂苷含量与人参皂苷生物合成相关基因表达之间联系。以四年生红果期西洋参的14个组织部位为材料,利用高效液相法和香草醛-硫酸比色法测定西洋参样本中6种单体皂苷（人参皂苷Rg1,Re,Rb1,Rc,Rb2,Rd）,分组皂苷和总皂苷含量;同时,利用实时荧光定量PCR法检测西洋参不同组织部位中7种（SQS,OSC,DS,β-AS,SQE,P450,FPS）人参皂苷生物合成相关基因的表达量。在西洋参中7种人参皂苷生物合成相关酶基因虽然参与人参皂苷合成,但是β-AS和P450基因的表达对单体皂苷,分组皂苷及总皂苷含量影响不显著;FPS,SQS,OSC,DS和SQE这5种基因表达对单体皂苷Re,Rg1,Rb1,Rd,分组皂苷PPD和PPT,单体总皂苷TMS和总皂苷TS含量影响显著或者极显著（P〈0.05或P〈0.01）。西洋参中部分单体皂苷,分组皂苷以及总皂苷的生物合成受着皂苷合成途径多种酶基因相互作用影响,生物合成途径中关键酶基因表达差异决定了西洋参中不同组织部位皂苷含量。因此,该研究通过相关性分析进一步明确了FPS,SQS,OSC,DS和SQE这5种酶基因是控制西洋参中皂苷合成的关键酶,它们通过集群协同表达互作的方式调控西洋参中人参皂苷的生物合成。

不同光照强度对西洋参生长、皂苷含量及基因表达的影响

适当的光照强度可以提高药用植物光合作用,利于植物积累生物量,提高关键酶活性,进而促进次生代谢产物的合成。为了解不同光强对西洋参生长及品质的综合影响,该研究采用4种不同光照强度40、80、120、160μmol·m^(-2)·s^(-1)进行温室砂培试验,测定了三年生西洋参的生长指标、光合特性以及6个人参皂苷的含量,同时检测了人参皂苷合成相关酶基因在西洋参叶、主根、须根的表达量。结果显示,在80μmol·m^(-2)·s^(-1)光照强度下,西洋参总生物量和净光合速率均最高;120μmol·m^(-2)·s^(-1)光强下的西洋参总生物量略低于80μmol·m^(-2)·s^(-1)处理,但根冠比达到6.86,显著高于其他处理(P<0.05);此时,地上及地下部分总皂苷的含量均最高,推测与叶中FPS、SQS、SQE、OSC、DS、P450基因以及主根中SQE、DS基因高表达有关。此外,该研究发现,120、160μmol·m^(-2)·s^(-1)光强可触发皂苷合成上游基因的上调表达,促进叶片中PPD型皂苷合成。然而,西洋参在弱光(40μmol·m^(-2)·s^(-1))和强光(160μmol·m^(-2)·s^(-1))下,叶片净光合速率、气孔导度、蒸腾速率均较低,地下物质积累减少;同时,主根中总皂苷含量下降,SQS、SQE、OSC、DS基因的表达量较低,而须根中皂苷含量与其合成酶相关基因表达相关性不强。综上,80、120μmol·m^(-2)·s^(-1)光强均有利于提高西洋参产量和质量。以上研究结果为西洋参栽培中的合理遮荫提供了理论依据,对通过光调控提高西洋参的产量和质量具有指导意义。

基于转录组的多花黄精与长梗黄精代谢途径分析

目的:获得多花黄精和长梗黄精根茎转录组信息特征,解析2种黄精属植物活性成分生物合成通路的异同点。方法:以多花黄精和长梗黄精根茎为研究对象,采用Illumina HiSeq测序平台进行高通量转录组测序并进行数据分析。结果:获得154778个Unigenes,其中注释差异表达Unigenes 14135个,GO功能可分类为51个,功能富集2076条,而多糖和薯蓣皂苷代谢显著性较差;KEGG富集到114条代谢通路,前20条通路中未见多糖和薯蓣皂苷相关代谢通路;782个Unigenes参与果糖和甘露糖、半乳糖、淀粉和蔗糖代谢途径,其中228个Unigenes编码3条多糖生物合成途径中13个关键酶,但只有35个Unigenes有显著性差异;270个Unigenes参与甾醇化合物、萜类化合物骨架和单萜类生物合成等5条甾体皂苷相关代谢途径,其中64个Unigenes编码薯蓣皂苷生物合成途径9个关键酶,仅6个Unigenes有显著性差异。结论:多花黄精与长梗黄精转录组差异性大,但在多糖和薯蓣皂苷相关代谢通路中的关键酶对应的Unigenes差异较少,该结果为日后扩大黄精药材植物资源以及深入研究黄精属转录组提供参考依据。

无患子RT-qPCR内参基因的筛选与验证

无患子根、茎、叶、花和果皮均含有生物活性物质三萜皂苷,为了解三萜皂苷生物合成途径中相关基因的表达水平,需要筛选稳定表达的内参基因。以无患子根、茎、叶、芽、雄花、雌花和不同发育时期的果皮为材料,根据无患子转录组数据,选择Sm18S,SmACT,SmTBCC,SmEF-1α,SmRPL1,SmRPS26,SmUBC12,SmUBP等8个基因作为候选内参基因。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测这些候选内参基因的表达量,并利用geNorm、NormFider和BestKeeper三个软件及RefFinder在线分析工具评价候选内参基因的稳定性。结果表明,8个候选内参基因的表达量在所有样本间的变化幅度存在差异;geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个软件筛选出的最佳内参基因略有不同;综合分析结果表明SmACT、SmRPL1和SmUBP表达较为稳定,SmEF-1α稳定性最差;以SmACT、SmACT+SmRPL1组合和SmACT+SmRPL1+SmUBP组合为内参对三萜皂苷生物合成途径中的8个候选基因进行校准所得的表达量基本上保持一致,且相对表达量结果与转录组数据基本保持一致,表明SmACT、SmACT+SmRPL1组合和SmACT+SmRPL1+SmUBP组合可作为无患子三萜皂苷生物合成途径相关基因表达研究的内参基因,同时也可以为无患子及近缘植物的其他生物学过程中的基因表达研究提供参考。

人参转录因子ERF基因家族的表达分析

ERF转录因子是植物最大的转录因子家族之一,对药用植物次生代谢具有重要的调控意义。该研究运用转录组热图方法从空间和时间2个层面分析了ERF家族基因的表达,筛选出6个可能参与人参皂苷调控的ERF基因。采用UPLC-MS/MS测定了不同浓度MeJA处理的人参不定根中人参皂苷Rg1,Re,Rb1的含量。运用实时荧光定量PCR测定MeJA处理的人参不定根中人参皂苷生物合成关键基因(DDS,CYP716A47,CYP716A53v2)和ERF家族基因的表达;采用Pearson相关对DDS,CYP716A47,CYP716A53v2基因与ERF家族基因表达特异性进行分析。结果表明,不同浓度MeJA处理的人参不定根中原人参二醇型人参皂苷Rb1含量上升,原人参三醇型人参皂苷Rg1和Re含量有所下降,与DDS,CYP716A47的表达量上升以及CYP716A53v2基因表达量下降相一致;ERF003,ERF118,ERF012的表达与CYP716A53v2呈显著正相关,而与DDS呈显著负相关,说明ERF003,ERF118,ERF012很可能通过抑制DDS表达和促进CYP716A53v2表达来调控人参皂苷合成;ERF1B表达则与CYP716A47呈显著负相关,说明ERF1B很可能抑制CYP716A47的表达从而参与调控人参皂苷合成。该文为后期深入研究ERF转录因子对于人参皂苷生物合成调控的功能验证奠定基础。