皖南蝮蛇毒抑瘤组分Ⅰ对人胃癌细胞SGC-7901荷瘤鼠体内抑制作用的研究

目的:研究皖南蝮蛇毒抑瘤组分Ⅰ(Agkis-trodon halys venom antitumor component Ⅰ,AHVAC-Ⅰ)对人胃癌细胞SGC-7901荷瘤鼠的体内抑制作用及瘤细胞增殖活性变化,并初步探讨其作用机制。方法:取生长状态良好的浓度为1×107个/mL的SGC-7901人胃癌细胞悬液0.1mL接种于裸小鼠右侧腋窝皮下,待其成瘤后随机分为模型组、紫杉醇阳性对照组、AH-VAC-Ⅰ高、中、低剂量组,隔日连续给药5次,定期观察肿瘤生长情况,测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率,HE染色观察瘤体形态学变化,免疫组化SP法检测Ki-67增殖指数,原位末端标记技术(TUNEL)法检测细胞凋亡指数。结果:AHVAC-Ⅰ在1.0mg/kg剂量时对SGC-7901细胞有抑制作用,抑瘤率达42.2%;在3.0mg/kg剂量时有显著抑制作用,抑瘤率达78.5%。实验组肿瘤内Ki-67阳性细胞数量下降,凋亡细胞明显增多。结论:AHVAC-Ⅰ能明显抑制裸鼠体内SGC-7901人胃癌细胞的生长,其作用机制可能与诱导胃癌细胞发生凋亡及抑制肿瘤细胞增殖有关。

皖南蝮蛇毒抑瘤组分-Ⅰ通过MMP2抑制三阴性乳腺癌细胞体外血管生成拟态

目的 探讨皖南蝮蛇毒抑瘤组分-Ⅰ(AHVAC-Ⅰ)对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231血管拟态能力的影响及其可能的作用机制。方法 采用CCK8实验根据半数抑制浓度(IC50)确定AHVAC-Ⅰ实验浓度,将MDA-MB-231细胞分为3组:对照组(不含药物的培养基处理)、AHVAC-Ⅰ实验组、药物对照组(5-Fu处理)。Matrigel实验检测分析不同浓度AHVAC-Ⅰ作用对MDA-MB-231血管拟态能力的影响。运用定量PCR和Western blot检测基质金属蛋白酶2(MMP2)与MMP9的表达水平。结果 相较对照组,5、10、20μg/mL AHVAC-Ⅰ可显著抑制MDA-MB-231细胞的血管拟态能力(P<0.01),且呈剂量依懒性。RT-PCR及Western blot结果显示,AHVAC-Ⅰ能够抑制MMP2的表达水平,降低三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌生成的MMP2(P<0.01),而MMP2的补入可恢复因AHVAC-Ⅰ作用而抑制的MDA-MB-231细胞血管拟态的能力。结论 AHVAC-Ⅰ可通过下调MMP2的表达,抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231血管生成拟态的形成能力。

皖南蝮蛇毒抑瘤组分-Ⅰ逆转原代胃癌相关成纤维细胞促癌作用

目的:探讨皖南蝮蛇毒抑瘤组分-Ⅰ(agkistrodon halys venom antitumor component-Ⅰ,AHVAC-Ⅰ)抑制胃癌细胞迁移的生物学活性。方法:组织块培养法和胰酶消化法分离培养人原代胃癌相关成纤维细胞(GCAFs);CCK8实验根据半数抑制浓度(IC 50)确定AHVAC-Ⅰ实验浓度;收集AHVAC-Ⅰ作用GCAFs后的上清液(GCAFs-CM^(AHVAC-Ⅰ)),划痕实验法和Transwell检测GCAFs-CM^(AHVAC-Ⅰ)抑制胃癌细胞株MKN-28迁移的能力;用ELISA、RT-PCR检测AHVAC-Ⅰ作用后GCAFs分泌产生的趋化因子CXCL12。结果:AHVAC-Ⅰ可显著抑制人原代GCAFs分泌的CXCL12(P<0.05),AHVAC-Ⅰ作用后生成的GCAFs-CM^(AHVAC-Ⅰ)明显抑制了胃癌细胞MKN-28的迁移能力(P<0.05)。结论:AHVAC-Ⅰ能够通过抑制GCAFs分泌生成的CXCL12抑制胃癌细胞MKN-28的迁移能力,逆转胃癌肿瘤微环境中的GCAFs的促进胃癌细胞转移的作用。

皖南蝮蛇毒通过血小板抑制肿瘤转移的研究

目的:探索皖南蝮蛇毒蛋白抑制人乳腺癌细胞MCF-7转移的机制。方法:光学比浊法测定血小板聚集率筛分皖南蝮蛇毒蛋白组分;用蛇毒蛋白干预乳腺癌细胞MCF-7与血小板细胞共培养体系,显微镜下观察细胞形态学变化;CCK-8法判断细胞增殖情况;ELISA法检测平足蛋白和P选择素分泌情况。结果:血小板与MCF-7细胞共培养体系在光学显微镜下观察到血小板聚集于MCF-7表面;1 mg/mL皖南蝮蛇毒蛋白组分Ⅱ具有明显的促进血小板聚集作用(P<0.01);共培养体系中随蛇毒蛋白浓度增大MCF-7的增殖率逐渐下降,但差异无统计学意义(P>0.05);酶联免疫检测结果显示,12.5、25μg/mL蛇毒蛋白组平足蛋白含量降低、P选择素分泌增多(P<0.05)。结论:皖南蝮蛇毒蛋白抑制人乳腺癌细胞MCF-7转移的机制与皖南蝮蛇毒蛋白组分Ⅱ结合血小板表面C型凝集素受体2的能力大于肿瘤细胞表面平足蛋白结合血小板表面C型凝集素受体2的能力有关。

皖南蝮蛇毒抑瘤组分-Ⅰ对人原代胃癌细胞增殖的影响

目的:探索皖南蝮蛇毒抑瘤组分-Ⅰ(agkistrodon halys venom antitumor componentⅠ,AHVAC-Ⅰ)对人原代胃癌细胞增殖的抑制和诱导发生凋亡的作用。方法:胰酶消化法分离人原代胃癌细胞,无血清培养液培养细胞和差速贴壁法纯化人原代胃癌细胞以及免疫组化法鉴定人原代胃癌细胞。采用细胞增殖和毒性检测(cell counting kit-8,CCK-8)法检测各浓度组的AHVAC-Ⅰ对胃癌原代细胞增殖抑制率。免疫组化法验证AHVAC-Ⅰ诱导人原代胃癌细胞发生凋亡和苏木素-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining,HE)法观察其形态学的变化。采用流式细胞术Annexin V/PI双染色法检测AHVAC-Ⅰ诱导人胃癌原代细胞凋亡率。结果:成功分离纯化人原代胃癌细胞7例,失败11例,免疫组化鉴定癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和广谱角质蛋白(broad spectrum keratin protein,AE1/AE3)两种抗体均表达阳性。AHVAC-Ⅰ能够抑制人原代胃癌细胞的增殖且呈现剂量效应(P<0.01)。免疫组化检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine aspartic protease-3,Caspase-3)表达水平随AHVAC-Ⅰ浓度的升高而升高,HE法观察随着AHVAC-Ⅰ浓度的升高细胞间隙增大、核固缩、凋亡细胞增多。流式细胞术检测人原代胃癌细胞凋亡率随AHVAC-Ⅰ浓度的增加而增加(P<0.05)。结论:AHVAC-Ⅰ能够抑制人原代胃癌细胞的增殖和诱导人原代胃癌细胞发生凋亡,且呈剂量效应。

Purification and Characterization of Cytotoxins from Agkistrodon acutus Venom and Their Anticancer Activity

Aim To investigate the anticancer activity of two new cytotoxins from thevenom of Agkistrodon acutus. Methods The venom was isolated by FPLC column chromatography consistingof DEAE Sepharose FF and Source 30S. The cytotoxic activity on tumor cells was detected by MITmethod. Purity and molecular weight were determined by SDS-PAGE (silver staining). Their stabilitiesto temperature and pH were also detected. Results Two pure cytotoxins named ACTX-6 and ACTX-8 wereobtained. Their molecular weights are 98 kDa and 27 kDa, respectively. ACTX-6 consists of twosubunits bonded together by disulfide bonds. Conclusion ACTX-6 and ATCX-8 have highest inhibitoryactivity on lung cancer cell A549. ACTX-6 is stable to heat while ACTX-8 not. ACTX-6 is stablebetween pH 7-9 and ACTX-8 between pH 6 - 9.