从江香猪FoxO 4基因真核表达载体的构建及其在皮下脂肪前体细胞中的表达

本研究旨在克隆从江香猪FoxO 4基因编码区序列,对FoxO 4基因功能进行初步探究。采用qRT-PCR技术对从江香猪(6月龄)不同组织中FoxO 4基因的相对表达量进行检测;PCR扩增FoxO 4基因CDS区,构建真核表达载体pEGFP-N3-FoxO 4;利用脂质体法将重组质粒pEGFP-N3-FoxO 4瞬时转染从江香猪皮下脂肪前体细胞,通过qRT-PCR方法,检测FoxO 4、PPARγ、LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL的表达水平。结果显示:FoxO 4基因在从江香猪脂肪组织中表达量最高;构建的重组真核表达载体pEGFP-N3-FoxO 4在从江香猪皮下脂肪前体细胞中成功表达,与对照组相比,LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL基因的表达均显著上调。综上表明,FoxO 4对脂质代谢具有一定的调控作用,可能是影响从江香猪猪肉品质的重要候选基因,为进一步了解从江香猪脂肪沉积机制提供理论基础。

从江香猪OB基因序列及对皮下脂肪前体细胞的调控研究

本文旨在探究从江香猪肥胖基因(OB sese,OB)的结构、性质以及在脂肪沉积过程中的表达调控,为进一步以从江香猪为肥胖症动物研究模型提供基础数据。研究通过提取纯种从江香猪、苏香杂交猪和大白猪心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、大肠、小肠、脂肪、背最长肌9个组织的总RNA,逆转录后经qRT-PCR检测不同猪种不同组织中mRNA的表达水平,扩增从江香猪OB基因全长CDS序列;测序后进行生物信息学分析,构建pEGFP-C1-OB表达载体并瞬时转染至培养的从江香猪皮下脂肪前体细胞中,检测各脂质代谢相关基因的表达规律。结果表明:OB基因在从江香猪各组织器官中均有表达,其在脂肪组织中的表达水平极显著高于其他组织;与GenBank登记的野猪(Sus Scrofa)序列相比较,存在241 bp处(T→C)和462处(G→T)2个同义突变位点;氨基酸第1位至22位为蛋白信号肽区域,同时存在一个螺旋跨膜结构,概率为84.63%。表达载体转染细胞后,OB基因上调导致神经肽Y(Neuropeptide Y,NPY)、乙酰辅酶A羧化酶A(Acetyl CoA carboxylase A,ACACA)、3-磷酸甘油酰基转移酶(Glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAM)的表达水平极显著提高,而二酰基甘油酰基转移酶1基因、脂蛋白脂酶、过氧化物酶体增殖激活受体γ、脂肪酸合成酶的表达水平极显著降低。

Myostatin通过ERK1/2-PPAR-γ通路抑制猪皮下脂肪前体细胞成脂分化的研究

旨在探讨细胞外信号调节激酶1/2-过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(ERK1/2-PPAR-γ)信号通路在肌肉生长抑制素(MSTN)抑制猪皮下脂肪前体细胞(PSPAs)成脂分化中的作用。PSPAs在诱导分化培养液(DIM)处理同时,随机分3组:对照组(0 ng/mL MSTN)、100 ng/mL MSTN组(100 ng/mL MSTN)以及ERK1/2特异性抑制剂PD98059和100 ng/mL MSTN联合组(PD98059+100 ng/mL MSTN)。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞增殖活力,油红O染色法及甘油三酯(TG)定量分析成脂分化,使用荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)、CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBP-α)、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、细胞外信号调节激酶(ERK)及其磷酸化ERK(p-ERK)表达。结果表明:细胞增殖活力在3组间无显著性差异(P>0.05)。与对照组相比,100 ng/mL MSTN处理48 h后细胞内脂滴沉积量、油红O阳性细胞数及TG含量均显著降低(P<0.05),PPAR-γ、C/EBP-α、FAS和ACC的mRNA表达量均显著下降(P<0.05),p-ERK/ERK比值显著增加(P<0.05);与100 ng/mL MSTN组相比,PD98059+100 ng/mL MSTN组p-ERK/ERK比值显著降低(P<0.05),而PPAR-γ、C/EBP-α、FAS和ACC的表达均显著升高(P<0.05),与此同时,细胞内脂滴沉积量、油红O阳性细胞数及TG含量均显著升高(P<0.05)。综上,ERK1/2-PPAR-γ信号通路可能介导了MSTN对PSPAs成脂分化的调控,结果为将MSTN作为抑制猪皮下脂肪沉积的分子靶点提供了新的理论依据。