皮状丝孢酵母利用大米草水解液发酵生产微生物油脂

研究了产油酵母菌皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)利用经过简单脱毒处理的大米草水解液,直接发酵生产微生物油脂。首先分别用1%、2%、4%和6%稀硫酸,在122℃水解大米草,大米草/硫酸(固/液比)为10%。结果表明,在6%的酸浓度下水解40 min后总还原糖含量最高。而1%稀硫酸在140℃下水解大米草,2.8 h后,水解液中葡萄糖产量达到最高14.2 g/L。然后将该条件下大米草水解液冷冻干燥浓缩为不同的倍数,作为皮状丝孢酵母菌的发酵培养基,水解液浓缩倍数为4.0时,产油量最高达6.0 g/L。为高效利用大米草,将大米草开发为一种能源植物,提供了新的途径。

紫外线诱变皮状丝孢酵母选育高产油脂菌株

以皮状丝孢酵母GIM 2.68为出发菌株,利用紫外线(UV)进行诱变,以筛选高产油脂突变菌株。通过测定吸光度和致死率绘制出发菌株的生长曲线与致死曲线,根据形态学和生理生化特征观察对菌种进行初筛,根据生物量和油脂产量检测对菌种进行复筛。研究结果表明:出发菌株生长周期为36 h,培养12 h后进入对数生长期;利用25 W紫外灯,在照射距离为36 cm条件下,照射时间为50 s,可以筛选出生物量为1.047 g/(100 mL)、油脂产量为0.374 8 g/(100 mL)的突变菌株Tc3,油脂得率为35.8%,与出发菌株相比,生物量提高38.81%,油脂产量提高86.10%,油脂得率提高34.09%。

复合诱变皮状丝孢酵母选育高产油脂菌株

采用紫外线与硫酸二乙酯对皮状丝孢酵母进行复合诱变。研究结果表明:用15 W紫外灯在照射距离30 cm条件下照射60 s,可以筛选到油脂含量30.4%,生物量1.135 4 g/100 mL的突变菌株皮-60;利用硫酸二乙酯诱变皮-60,在硫酸二乙酯质量分数1.0%,处理时间为70 min条件下,可以筛选到油脂含量35.7%,生物量1.257 3 g/100 mL的突变菌株皮-60-70,较出发菌株,油脂含量提高了33.7%。

皮状丝孢酵母同步利用葡萄糖/木糖的糖转运动力学

皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)能够同步利用葡萄糖和木糖生产油脂。以2-脱氧葡萄糖(2-DOG)为底物,考察皮状丝孢酵母糖跨膜运输的转运动力学。结果表明:2-DOG转运符合米氏方程,表观米氏常数K m为0.19 mmol/L,最大转运速率V max为14.1 nmol/(min·mg)。葡萄糖和木糖均竞争性抑制2-DOG转运,葡萄糖表观抑制常数K i远低于木糖,表明存在一个共用转运体系,且该转运体系对葡萄糖亲和力更高。大量木糖与2-DOG同时转运到胞内,进一步说明木糖与葡萄糖共运输。代谢抑制剂和pH对糖转运有明显影响,说明质子/底物同向运输系统是该酵母的主要糖转运系统。

菊芋提取液的皮状丝孢酵母发酵产油脂试验研究

以皮状丝孢酵母为产油脂菌种,研究其发酵菊糖提取液产油脂情况。首先研究了从菊芋中提取菊糖的条件,获得最适提取条件为:温度85℃,时间80 min,菊芋粉质量浓度70 g/L,在此最优提取条件下,菊糖提取率达95%;然后考察了pH值、接种量、培养温度和氮源对皮状丝孢酵母发酵菊糖提取液产油脂的影响,获得最优条件为:初始pH值5.5、培养温度30℃、接种量10%。在此优化条件下,5 L发酵罐分批扩大培养,其生物量、出油率和油脂得率分别达到13.93 g/L、34.73%和4.89 g/L。补充添加氮源对生物量、出油率和油脂得率的提高不显著。气相色谱法测定脂肪酸成分主要是C16和C18系列,其中80.2%以上是C16:0、C18:1和C18:2,尤其是C18:1(43%),其油酸、棕榈酸和亚油酸占总脂肪酸的比例和植物油脂非常接近。

利用皮状丝孢酵母对甘蔗渣酶解液产油脂的研究

本试验旨在研究碱和高温液态水2种预处理方式对发酵的影响。甘蔗渣分别利用碱和高温液态水(LHW)预处理,然后使用纤维素酶进行酶解。在LHW和碱预处理后的酶解液中,分别含22.06和39.28 g/L总糖。不经过浓缩,也不需要添加任何营养物质,酶解液被用于皮状丝孢酵母的油脂发酵试验。经过3 d的培养,在LHW预处理的酶解液中,皮状丝孢酵母的生物量达到了8.08 g/L,油脂质量分数为52.00%,油脂系数高达19.03%。在碱预处理的酶解液中,经过8 d的培养,皮状丝孢酵母的生物量为13.67 g/L,油脂质量分数为43.20%,油脂系数为15.03%。脂肪酸组成分析表明所产油脂与棕榈油的组成相似。试验结果表明,甘蔗渣是一种有前景的产油脂原料,LHW是一种良好的预处理方式。该研究为利用甘蔗渣发酵产油脂提供了新思路。

皮状丝孢酵母发酵丢糟水解液的应用研究

采用正交试验研究了硫酸水解丢糟的最佳工艺与皮状丝孢酵母发酵丢糟水解液生产微生物油脂的最佳工艺。结果表明:最佳丢糟酸水解工艺条件为硫酸添加量8%(9 mol/L),水解温度90℃,水解时间1.5 h;在最佳水解条件下,丢糟水解液中还原糖含量为1.51%。最佳皮状丝孢酵母发酵丢糟水解液生产微生物油脂的工艺条件为接种量8%,发酵温度32℃,蔗糖添加量0.8%,发酵时间3 d;在最佳发酵条件下,菌体的油脂含量可达24.86%。

皮状丝孢酵母在酶法水解丢糟生产微生物油脂中的应用

以大曲丢糟为主要原料,利用纤维素酶为催化剂,以皮状丝孢酵母为生产菌,采用正交试验进行微生物油脂发酵研究。结果表明,丢糟酶解的最佳工艺条件为:纤维素酶添加量为0.5%,水解温度为55℃,水解时间1.5h,所得丢糟水解液还原糖含量为9.83%;皮状丝孢酵母发酵丢糟水解液生产微生物油脂的最佳工艺条件为:皮状丝孢酵母接种量为11%,培养温度为26℃,培养时间为7d,培养基的糖度为9°P。在最佳条件下测得皮状丝孢酵母生物量为0.3549g/100mL,油脂含量为23.89%。

关于皮状丝孢酵母（Trichosporon cutaneum）ST851破壁条件的研究

用脱壁酶（纤维素酶、半纤维素酶和蜗牛酶）作用于皮状丝孢酵母ＳＴ８５１制备原生质体。本文就酶的种类、酶液浓度、酶作用时间与温度、酶混合时间、混酶作用效果、酵母细胞的不同生长期诸因素对ＳＴ８５１原生质体形成的影响，进行了较为详尽的探讨。结果表明采用混酶作用（即先用纤维素酶和半纤维素酶预处理后再用蜗牛酶作用）是较理想的破壁条件，在ｐＨ５．８、３７℃条件下作用３．５－４ｈｒ，破壁率最高可达９５－９８％。

皮状丝孢酵母脂肪酸CoA连接酶(Facl)基因的克隆与分析

从皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)中克隆了Facl基因及其5'-上游序列,并对Facl基因及其5'-上游序列进行了分析。根据前期的基因组文库测序结果,获得了898 bp DNA序列。以此为基础,2次使用染色体步移(Genome walking)方法,分别获得了854 bp和1 236 bp 5'-DNA序列。根据获得的5'和3'端序列,合成引物用于扩增Facl基因的全长DNA和c DNA序列。分析发现,皮状丝孢酵母Facl基因c DNA包含一个1 662 bp的开放读码框,DNA不含内含子序列。同时获得了482 bp的5'-上游序列。在5'-上游序列区域存在一系列预测的顺式作用元件。相似性分析的结果表明T.cutaneum和Rhodococcus erythropolis的Facl氨基酸序列相似性最高。该研究旨在为后继的Facl基因的功能和表达的研究、油脂代谢的遗传改造奠定基础。

挤压针回抽速度对不锈钢管内表面橘皮状褶皱缺陷的影响

通过有限元模拟法分析了挤压针回抽速度对不锈钢挤压管尾部内表面的影响,对比了150、50、25、12.5、10mm/s五个不同回抽速度的尾部内表面。结果表明,随着回抽速度的降低,尾部内表面橘皮状缺陷明显得到缓解。以50mm/s的速度回抽时,挤压出的不锈钢管会发生回退现象;当回抽速度下降到10 mm/s以下时,橘皮状褶皱缺陷基本消失。在挤压准?219 mm×11 mm管时,尾部橘皮状褶皱缺陷段的长度正是挤压针长度减去与挤压筒模配合段后的长度和挤压针导向段长度。

常压室温等离子体诱变选育高产油脂皮状丝孢酵母的研究

研究了常压室温等离子体(ARTP)诱变时间对皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)致死率的影响,考察了不同质量浓度芝麻酚对皮状丝孢酵母生长的抑制程度,建立了一种快速高效选育高产油脂菌株的方法。结果表明:经过ARTP的40 s诱变后,接种到质量浓度为0. 15 mg/m L的芝麻酚培养基中28℃培养2 d,筛选出生长旺盛的菌株,然后接种到48孔液体培养基培养,并利用96孔板尼罗红荧光染色对培养菌株进行高通量筛选,选育出一株高产油脂菌株Trichosporon cutaneum A1。该菌株较原始菌株的生物量、油脂产量、油脂含量分别提高了41. 6%、123. 1%、57. 4%,且具有较好的遗传稳定性;通过气相色谱分析,其油脂脂肪酸组成与原始菌株相同,均为十六烷酸、硬脂酸、油酸、亚油酸。说明建立的芝麻酚抗性筛选和荧光标记高通量筛选相结合的ARTP选育方法是可行的,为其他产油脂菌株的筛选提供重要参考。

皮状丝孢酵母产油脂的研究

本文对皮状丝孢酵母的生长发育和油脂合成进行了研究,监测和分析了酵母菌生长发育、油脂合成和脂肪酸成分及数量,检测了形态、OD值、糖氮代谢、p H、生物量、油脂含量和脂肪酸组分。结果表明:皮状丝孢酵母生长80 h左右时镜检测得菌细胞体内含油脂情况与80 h左右时实际提油获得的油脂量相一致,其油脂产量为3.66 g/L,含油率约为39.20%。皮状丝孢酵母生长0~6 h为适应期,此时糖氮的消耗明显,细胞数量缓慢增加;6~25 h为对数期,氮消耗非常显著,细胞数量急剧增加,细胞变大;25~120 h为稳定期,糖的消耗明显,消耗速度显然大于氮的消耗,细胞内开始慢慢积累油脂;之后为衰退期,氮的消耗基本趋于平稳。皮状丝孢酵母所产脂肪酸主要以C16、C18为主,此类脂肪酸适于进行脂交换制备生物柴油。

皮状丝孢酵母的高温驯化及细胞膜脂肪酸组成的测定

通过对产油皮状丝孢酵母T.cutaneum CX1进行高温驯化及平板筛选，获得7株耐高温菌株G1～G7。在42℃条件下耐高温菌株G3菌体干重、含油量及合油率分别为11．13、1．33g／L及11．95％，较原始菌株分别提高32．8％、46．2％及10．0％，发酵优势明显。细胞膜脂肪酸组成的测定结果表明，同原始菌株相比，耐高温菌株G3细胞膜中饱和脂肪酸含量更高。当培养温度升高时，耐高温菌株G3细胞膜中饱和脂肪酸含量会进一步上升。

皮状丝孢酵母发酵菊粉产油脂培养基的优化

采用Plaekett-Burman设计和响应面分析法,对皮状丝孢酵母菌发酵菊粉产油脂的培养基进行优化。首先用Plaekett-Burman设计对发酵培养基组分菊粉、酵母膏、硝酸钾、硫酸镁、硫酸铁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锌等进行评价并筛选出了有显著效应的酵母膏、硫酸锌、氯化钙,然后用最陡爬坡路径逼近最大响应值区域,最后再利用Box-Behnken试验设计及响应面分析法进行回归分析。结果表明酵母膏、硫酸锌、氯化钙于油脂含量存在显著的相关性。通过求解回归方程得到优化发酵培养基组分:酵母膏6.68g/L、硫酸锌0.457g/L、氯化钙0.342g/L。对优化后的培养基进行发酵培养,其生物量和油脂含量分别达到了13.56g/L、5.281g/L,油脂含量比优化之前增加了11.2%。

皮状丝孢酵母菌发酵菊粉产油脂的研究

因皮状丝孢酵母是一株高产油脂酵母,对皮状丝孢酵母发酵菊粉产油脂进行了研究。考察了盐酸水解、菊粉酶水解及菊粉酶添加量对皮状丝孢酵母发酵菊粉产油脂的影响,实验结果表明:酶解菊粉的方法优于酸解,当菊粉酶添加量为80U/50mL发酵液时,皮状丝孢酵母生物量和油脂含量最高,分别达到13.49g/L和5.26g/L,油脂得率达到39%。皮状丝孢酵母发酵菊粉产的油脂中脂肪酸成分以含16和18个碳原子的长链脂肪酸为主,其中80.5%以上是C16:0、C18:1和C18:2,尤其是C18:1(53.1%)。因此,皮状丝孢酵母发酵菊粉生产的油脂可作制备生物柴油的替代原料。

响应面法优化皮状丝孢酵母产油脂发酵培养基

以皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)为出发菌株,对其产油脂的发酵培养基进行研究。以油脂产量为评价指标,通过单因素试验研究发酵培养基中的碳源、氮源、外源因子对油脂产量的影响,然后利用响应面试验对培养基进行优化。结果表明,最佳培养基配方为葡萄糖97.6 g/L、玉米浆干粉4.4 g/L、乙酸钠0.09 g/L。在该优化条件下,皮状丝孢酵母的油脂产量达到了14.4 g/L。

醋酸尼泼松对皮状丝孢酵母产微生物油脂的影响

研究了醋酸泼尼松对皮状丝孢酵母生长和油脂积累的影响.结果表明:添加醋酸泼尼松100mg/L,可以有效促进皮状丝孢酵母的生长,使皮状丝孢酵母生物量达到最大,比未添加醋酸泼尼松提高68%;一次添加醋酸泼尼松200mg/L,对皮状丝孢酵母油脂积累油脂最为明显,可以提高98%的产量;如果采用分批添加醋酸泼尼松200mg/L,即30h前使添加醋酸泼尼松维持100mg/L,30h后补加醋酸泼尼松,维持在200mg/L,微生物油脂产量可以从最初2.5g/L提高到5.7g/L,产量提高128%;通过气相检测发现醋酸泼尼松的添加对酵母油脂脂肪酸的组成含量也有影响,油酸、亚油酸含量分别增加21.6%、32.3%.本文为提高皮状丝孢酵母生物量和油脂积累提供了一种新的方法.

产油皮状丝孢酵母突变株的转录组分析

对产油皮状丝孢酵母进行常压室温等离子体(ARTP)诱变,筛选得到一株高产菌株A1。为了进一步研究高产菌株A1的基因表达和代谢通路的变化,利用转录组测序手段,对原始菌株WT和高产菌株A1进行发酵培养至油脂积累最大值时,然后进行转录组测序分析。结果表明:A1与WT相比,有1185个显著基因差异表达,其中767个基因表达上调,418个基因表达下调;利用差异基因GO富集分析发现,与细胞过程、代谢过程、催化活性、细胞部分等相关的基因表现出富集;在KEEG代谢通路中,差异基因主要涉及酵母细胞周期、基因复制、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、糖酵解/糖异生等过程。研究发现3个与脂肪酸积累相关的酶过表达,分别为柠檬酸合成酶、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶。这些结果可为后期的油脂酵母基因改造和代谢通路调控提供理论依据。

阿魏酸对皮状丝孢酵母细胞生长与油脂积累影响的研究

本研究首次研究了阿魏酸对皮状丝孢酵母细胞生长与油脂积累的影响。研究表明,低浓度下,阿魏酸对皮状丝孢酵母细胞生长影响不大,且会对其油脂积累略有促进。但在高浓度下会对皮状丝孢酵母的细胞生长与油脂积累产生明显的抑制。阿魏酸对皮状丝孢酵母糖代谢的影响部分解释了其对皮状丝孢酵母细胞生长与油脂积累的影响。此外,阿魏酸对皮状丝孢酵母的油脂脂肪酸组成也会造成一定影响。