绵羊皮肤前体细胞体外分离培养及特征鉴定

本研究建立绵羊皮肤前体细胞(skin-derived precursor cells,SKPs)体外快速分离方法,为体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)技术提供理想的供体细胞。试验采用组织块贴壁法从绵羊耳组织中分离获得成纤维细胞;P3代成纤维细胞通过汉克斯平衡盐(Hanks’Balanced Salt Solution,HBSS)(pH=5.7)进行急性酸胁迫处理15 min获得SKPs并命名为pH-SKPs;采用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)、免疫荧光技术和测定生长曲线对成纤维细胞和pH-SKPs进行鉴定;此外,在含15%FBS的杜氏改良Eagle培养基—高葡萄糖(DMEM-high glucose,DMEM)中诱导pH-SKPs分化为成纤维细胞,以验证pH-SKPs的分化潜能。结果显示组织块贴壁法获得的绵羊成纤维细胞呈典型的梭形;RT-PCR检测发现细胞中表达成纤维细胞特异性基因Vimentin;免疫荧光检测发现细胞中成纤维细胞标志蛋白纤粘蛋白(fibronectin)和波形蛋白(vimentin)呈阳性表达,表明分离的细胞具有成纤维细胞特性。酸胁迫处理成纤维细胞获得的pH-SKPs呈球形并悬浮生长;RT-PCR检测发现细胞中表达多能性标记基因NANOG、OCT4和SOX2,神经嵴标记基因PAX3和Nestin以及成纤维细胞标志基因Vimentin;免疫荧光检测发现细胞中干细胞标志蛋白SOX2、NANOG和OCT4呈阳性表达,表明pH-SKPs具有干细胞特性;pH-SKPs中巢蛋白(nestin)、Vimentin、Fibronectin和平滑肌蛋白(smooth muscle actin,SMA)呈阳性表达,表明其具有分化为神经元、成纤维细胞和平滑肌细胞的潜能。成纤维细胞和pH-SKPs的生长基本符合S型生长规律。pH-SKPs分化后的细胞表达Vimentin基因和标志蛋白Vimentin,表明其具有分化为成纤维细胞的特性。本研究成功应用急性酸胁迫处理绵羊成纤维细胞获得pH-SKPs,为绵羊SCNT研究提供理想的供体细胞。

皮肤源性前体细胞的研究进展

皮肤源性前体细胞(SKPs)是一种能从胚胎及成年真皮中提取的神经嵴来源的新的前体细胞,因其具有来源丰富、易于获取、具有多向分化潜能、无伦理限制等优点,在疾病治疗等方面均具有重要的研究意义和良好的应用前景。本文就SKPs的来源、定位、增殖与分化等对其研究进展作一综述。SKPs来源于胚胎神经嵴,但不同部位的SKPs来源亦略有不同。SKPs广泛存在于皮肤真皮中,DP是SKPs的一个富集龛,真皮层内的毛细血管周即是SKPs的另一富集龛,但关于SKPs体内富集龛位置的确定,仍需进一步的探索。SKPs可行自体移植并具有多向分化潜能,在机体多种组织修复和疾病治疗中有着重要的研究价值。

皮肤源性前体细胞经不同方式移植后在大鼠损伤脊髓中存活情况及对功能恢复的影响

目的:观察皮肤源性前体细胞(SKPs)经不同方式移植在大鼠的损伤脊髓中的存活情况及对功能恢复的作用。方法:分离雄性大鼠SKPs并检测其迁移能力。Allen法制备大鼠脊髓损伤模型后,将DAPI标记的SKPs经局部注射(A组)、尾静脉(B组)、脑脊液(C组)移植到雌性大鼠体内。伤后第3天和第7天取材WesternBlot检测损伤局部趋化因子的表达,荧光显微镜观察和实时定量PCR法检测脊髓中SKPs含量。BBB法评价大鼠功能恢复情况。结果:SKPs具有很强的迁移能力。损伤局部趋化因子的表达上调,移植后第7天B组和C组脊髓SKPs数量较第3天时增加,但均低于A组;而伤后第7天B组和C组大鼠的功能恢复好于A组。结论:经静脉和脑脊液移植的SKPs可在损伤脊髓局部上调表达趋化因子的作用下迁移到损伤局部并存活,功能恢复优于局部注射法。

不同时相点移植的皮肤源性前体细胞在损伤脊髓中的存活数量及其机制

目的:观察不同时相点移植的皮肤源性前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)在损伤脊髓中的存活数量并探讨其可能的机制。方法:分离雄性大鼠SKPs,Allen法制备雌性大鼠中度脊髓挫伤模型,伤后即刻、1d、3d、7d和14d取损伤脊髓匀浆离心取上清液,酶联免疫吸附法测定上清液中白介素-1(IL-1)和血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)的含量,然后观察上清液、IL-1和PDGF对SKPs增殖和凋亡的影响。上述同样的时相点将DAPI标记的SKPs经局部注射到损伤脊髓处,移植后14d取材采用针对Y染色体的实时定量PCR检测脊髓中SKPs含量,BBB法评价大鼠功能恢复情况。结果:IL-1可抑制SKPs的增殖活性,促进其凋亡;而PDGF的作用相反。损伤3d后脊髓的提取液培养中IL-1的浓度最高,7d的PDGF浓度最高,7d的脊髓提取液对SKPs促增殖活性最高。伤后7d移植组损伤脊髓局部存活的SKPs数量最多,功能恢复也最好。结论:中度挫伤脊髓损伤后7d移植SKPs存活率最高,对功能恢复的作用最强,其可能机制与损伤脊髓局部表达的细胞因子有关。

皮肤源性前体细胞的生物学特性与临床应用

背景:皮肤源性前体细胞是一种神经嵴来源的前体细胞,具有多向分化潜能。目的:对皮肤源性前体细胞的培养分离、生物学特性以及临床应用前景作一综述。方法:应用计算机检索PubMed数据库2001-01/2011-01相关文献,以"skin-derived precursor cells,skin-derived precursors,SKPs"为检索词;共检索到文献137篇,最终纳入符合标准的文献36篇。结果与结论:皮肤源性前体细胞具有来源丰富、易于获取和多向分化的潜能等优点,能够分化为在体内外都有功能的Schwann细胞、骨样细胞和胰岛素样细胞等多种细胞类型。其在多种组织修复和疾病治疗,特别是神经损伤再修复中显示了良好的应用前景。但其研究仍存在一些问题,需要进一步深入研究。

皮肤源性前体细胞的分离及其向神经系统细胞的诱导分化研究

目的:观察可否从截瘫病人皮肤中分离到皮肤源性前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)并诱导成神经系统细胞。方法:手术时从胸椎骨折伴或不伴截瘫病人切口边缘取2 cm^(2)皮肤,剪成1~2 mm^(3)碎片胰酶消化4 h。去除表皮层,吹打后过滤离心收集细胞进行培养。细胞荧光组织化学检测其细胞表型,并进行向神经系统细胞诱导分化。结果:成功地从截瘫病人皮肤中分离到SKPs,和非截瘫者相比其生物学特性无明显差异,均表达nestin等细胞表型,可被诱导为神经元和施万细胞。结论:可从截瘫病人皮肤分离SKPs并被诱导为神经系统细胞,提示其在脊髓损伤的自体细胞移植中具有良好的应用前景。

血清浓度对皮肤源性前体细胞在生物材料上增殖生长的影响

目的:探讨血清浓度对皮肤源性前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)在蝶翅及壳聚糖膜等生物材料表面增殖生长的影响。方法:采用酶消化法从新生大鼠背部皮肤分离纯化SKPs,将传代后的SKPs分别与具有不同表面结构的蝶翅和壳聚糖膜材料共培养,各组材料分别采用含有1%、5%、10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)浓度的培养基条件,培养4、24、48 h后以细胞活性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测各组材料上细胞活力,培养48 h采用倒置显微镜观察SKPs在材料上的贴壁和生长情况。结果:分离纯化的SKPs在各组材料上均能贴壁生长。在蝶翅材料上培养4、24 h后,CCK-8检测结果显示在含有1%FBS浓度培养基条件下SKPs的活力显著低于5%和10%FBS,培养48 h后倒置显微镜下观察,可见1%FBS条件下,细胞大量裂解出现碎片,5%和10%FBS培养条件下,SKPs均生长形态正常,两种蝶翅材料间差异无统计学意义。与蝶翅材料相似,SKPs在具有不同表面形貌的壳聚糖膜各组材料上培养,在1%FBS条件下各种表面形貌壳聚糖膜上SKPs的活力均显著低于5%和10%FBS,且培养48 h,细胞出现大量裂解碎片,5%和10%FBS下SKPs生长形态正常。结论:在具有表面微纳拓扑结构的生物材料上,1%低血清浓度不利于SKPs的生长,5%较低血清浓度可以满足SKPs细胞增殖生长的需要。

皮肤源性再程序化神经干细胞的制备以及定向分化为神经细胞的体外研究

目的:研究制备皮肤源性再程序化神经干细胞以及诱导其定向分化为神经细胞的可行性。方法:体外培养大鼠皮肤来源前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)并纯化、鉴定,用含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体系统作为基因转染工具,将第3代SKPs分3组:A组为慢病毒载体介导neurogenin2(Ngn2)基因转染的SKPs;B组为空载体慢病毒转染的SKPs;C组为未进行慢病毒介导基因转染的SKPs;7天后加入无生长因子含10%胎牛血清的诱导培养基诱导7天。光镜下观察比较各组细胞形态变化以及免疫荧光镜下研究各组SKPs诱导后定向分化为神经细胞的差异。结果:A组SKPs转基因后到第7天绿色荧光达到高峰,并可持续稳定表达绿色荧光至第8代;诱导7天后绝大部分细胞类似神经细胞,胞体呈梭形或椭圆形,有多个突起伸出;免疫荧光结果显示90.98%细胞表达微管相关蛋白-2(MAP-2),62.23%细胞表达神经元特异性蛋白NeuN。B组SKPs在空病毒转染7天以后有绿色荧光;诱导7天以后大多数细胞较诱导前无明显变化;免疫荧光结果显示,有34.35%的细胞表达MAP-2,无神经元特异性蛋白NeuN的表达。C组SKPs无绿色荧光;诱导7天以后大多数细胞较诱导前无明显变化;免疫荧光结果显示,29.54%的细胞表达MAP-2,无神经元特异性蛋白NeuN的表达。结论:慢病毒介导Ngn2基因转染SKPs可以制备出皮肤源性再程序化的神经干细胞,并提高其定向分化为神经细胞的能力。

维甲酸联合Purmorphamine诱导皮肤源性前体细胞向运动神经元分化的研究

目的探索利用维甲酸（mtinoicacid，RA）和Punnorphamine（PM）诱导皮肤源性前体细胞（skin—derivedprecursors，SKPs）向运动神经元（motorneurons，MNs）分化，为运动神经元移植治疗失神经肌萎缩提供依据。方法从新生大鼠皮肤分离SKPs，进行培养、增殖，采用免疫细胞化学法检测SKPs标记物巢蛋白（Nestin）和纤维连接蛋白（Fibronectin）的表达。使用RA、PM作为诱导因子，诱导第3代SKPs细胞球向MNs分化；添加GDNF、BDNF等生长因子促使轴突延长，形成成熟的MNs。通过免疫细胞化学法检测MNs标记物HB9和胆碱乙酰转移酶（cholineacetyltransferase，ChAT）的表达，鉴定分化细胞是否为MNs，并计算ChAT、HB9阳性率。结果利用RA、PM诱导SKPs分化后的细胞具有MNs的形态，并表达其标记物HB9、ChAT。ChAT阳性率为（72．61±2．25）％，HB9阳性率为（75．16±3．62）％。结论利用RA、PM可诱导SKPs向MNs分化。

基于SKP-SCs来源的胞外囊泡构建的组织工程神经移植物的生物安全性评价

目的:评价基于皮肤源性前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)分化成的施万细胞(Schwann cells,SCs)来源的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)构建的组织工程神经移植物(tissue engineered nerve graft,TENG)的生物安全性。方法:将SKP-SCs来源的EVs(SKP-SC-EVs)注射至带有3根纤维支架的壳聚糖导管中制备成TENGs,修复比格犬坐骨神经40 mm缺损。术后6个月,取心、肝、脾、肺、肾、脑,通过HE染色进行形态学观察,并收集血液进行血液常规和生化指标分析,包括:白细胞、中性粒细胞、红细胞、血小板、总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶和血糖等。结果:形态学分析显示TENGs组比格犬的各脏器组织结构清晰,与自体移植组、壳聚糖导管组相比,各项血液指标差异均无统计学意义(均P>0.05),且未见毒性反应改变。结论:基于SKP-SC-EVs构建的TENGs植入比格犬体内具有良好的生物安全性,为临床应用TENGs治疗周围神经损伤提供安全性数据支持。

真皮干细胞SKPs抗体外三维皮肤光损伤的作用

目的探讨真皮干细胞即皮肤前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)抗体外三维(three-dimensional,3D)皮肤光损伤的作用,为皮肤光损伤的治疗提供实验依据。方法按既往SKPs培养方法,采用悬浮培养法从新生小鼠真皮中分离、培养SKPs。同前期构建3D皮肤方法,以Ⅰ型胶原为支架,接种来自儿童包皮的原代培养的角质形成细胞(keratinocytes,KC)和成纤维细胞(fibroblasts,FBs)构建体外3D皮肤模型。然后将3D皮肤模型分为模型组、治疗组和对照组。在照射前24h,将SKPs细胞悬液和Hanks液各25μL分别注入治疗组和对照组,模型组未做处理。然后,予以UVA和UVB混合单剂量照射三组3D皮肤。照射后继续培养,72h后收集皮肤和上清液。HE染色观察各组皮肤组织病理学改变、TUNEL染色分析细胞凋亡情况以及ELISA检测SOD、CAT、MDA等氧化应激指标的变化。结果原代培养SKPs呈悬浮生长的圆形或椭圆形克隆样细胞球。3D皮肤经UV照射后,其表皮细胞肿胀排列紊乱、核浓缩,基底细胞部分液化变性,真皮胶原降解且FBs明显减少;凋亡细胞明显增加、凋亡指数AI值升高(P<0.05);SOD、CAT和GSHPx表达降低(P<0.05),而MDA水平升高(P<0.05)。但经SKPs注射后,KC整齐清晰仅轻度肿胀,核浓缩不明显,FBs轻微减少,未见细胞坏死及胶原降解;凋亡细胞显著减少、AI值下降(P<0.05);SOD、CAT和GSH-Px水平显著升高(P<0.05),MDA明显降低(P<0.05)。而对照组无明显改善。结论 SKPs能抗UV诱导的3D皮肤损伤,为皮肤光损伤的治疗奠定基础。

应用旋转灌注式生物反应系统体外构建组织工程神经的研究

目的:模拟微重力建立体外构建组织工程神经的方法,评价微重力环境对支持细胞生长的影响。方法:将皮肤前体细胞诱导分化的施万细胞作为支持细胞,联合壳聚糖神经导管、聚乳酸乙醇酸共聚物纤维支架,利用旋转灌注式生物反应系统体外培养,对照组为传统的静止培养。培养不同时间点取样,利用结晶紫染色,免疫荧光细胞化学染色,CCK-8细胞活力检测,扫描电子显微镜等方法观察支持细胞的生长状况。结果:体外培养7天后CCK-8细胞活力检测提示贴附在导管和纤维支架表面的细胞数量最多、活力最好,应用旋转灌注式生物反应系统体外培养较对照组高出约2倍,随后在14天、21天时略有下降;结晶紫染色及扫描电子显微镜观察显示7天时,与对照组相比,实验组支持细胞呈立体生长,分泌大量细胞外基质,生长状态更好;S100荧光免疫细胞化学染色显示微重力环境下施万细胞的标志物未发生改变。结论:模拟微重力环境较传统静止培养能更高效、优质地在体外构建组织工程神经。

真皮干细胞SKPs对银屑病样小鼠模型治疗作用分析

目的探讨真皮干细胞即皮肤源性前体细胞(SKPs)对银屑病样小鼠模型的治疗效果及其可能的作用机制。方法将20只BALB/c无毛小鼠随机分为:模型组[仅外用咪喹莫特乳膏(IMQ)]、治疗组(外用IMQ+皮内注射SKPs)、对照组(外用IMQ+皮内注射培养基)和凡士林组(仅外用凡士林)。肉眼观察小鼠皮肤外观,行银屑病面积与严重指数(PASI)评分。分离小鼠脾脏计算脾脏体重指数(SI);取背部皮肤行HE染色检测病理组织学改变;采用ELISA法检测各组血清中SOD、GSH、CAT、MDA、ROS、IL-17、IL-23的蛋白水平;qPCR检测皮肤组织中MAPK、NF-κb、SOD、GSH、iNOS、ROS、CAT、IL-17、IL-23 mRNA等基因的表达。结果模型组小鼠皮肤出现片状红斑/斑块上覆厚层鳞屑,局部浸润明显,PASI评分显著升高,病理可见角化过度、角化不全、棘层增厚,颗粒层变薄,真皮大量炎症细胞浸润等,而凡士林组则无上述表现。然而经SKPs局部注射后,治疗组小鼠皮肤红斑大部分消退、鳞屑减少,局部浸润减轻,PASI评分降低和病理表现明显改善(P<0.05);但对照组皮损和病理表现无改善、PASI评分无下降。同时模型组SI升高,MDA、ROS、IL-17、IL-23蛋白水平及MAPK、NF-κb、iNOS、ROS、IL-17、IL-23基因表达显著升高(P<0.05),而CAT、SOD、GSH蛋白及基因表达明显降低(P<0.05)。但SKPs明显降低SI以及上述炎症因子和氧化物的蛋白/基因表达水平,提升CAT等抗氧化物蛋白/基因水平(P<0.05),即治疗组均较模型组和对照组显著改善(P<0.05);而对照组较模型组无明显变化(P>0.05)。结论SKPs能较好改善银屑病样鼠皮损,减轻炎症及氧化应激损伤,可能是通过阻断MAPK/NF-κB表达进而抑制炎症因子释放、增强抗氧化能力而作用。

两类真皮干细胞的比较

真皮干细胞是一类有广泛应用前景的再生医学种子细胞。按照体外培养细胞形态,真皮干细胞主要有两类,一为贴壁生长的间充质干细胞,二为悬浮生长的皮肤前体细胞。本文就两类细胞的异同与相互关系进行综述,从其分离培养方法、形态学、标志物、分化潜能等方面展开比较讨论。