皮肤源性前体细胞的研究进展

皮肤源性前体细胞(SKPs)是一种能从胚胎及成年真皮中提取的神经嵴来源的新的前体细胞,因其具有来源丰富、易于获取、具有多向分化潜能、无伦理限制等优点,在疾病治疗等方面均具有重要的研究意义和良好的应用前景。本文就SKPs的来源、定位、增殖与分化等对其研究进展作一综述。SKPs来源于胚胎神经嵴,但不同部位的SKPs来源亦略有不同。SKPs广泛存在于皮肤真皮中,DP是SKPs的一个富集龛,真皮层内的毛细血管周即是SKPs的另一富集龛,但关于SKPs体内富集龛位置的确定,仍需进一步的探索。SKPs可行自体移植并具有多向分化潜能,在机体多种组织修复和疾病治疗中有着重要的研究价值。

皮肤源性前体细胞经不同方式移植后在大鼠损伤脊髓中存活情况及对功能恢复的影响

目的:观察皮肤源性前体细胞(SKPs)经不同方式移植在大鼠的损伤脊髓中的存活情况及对功能恢复的作用。方法:分离雄性大鼠SKPs并检测其迁移能力。Allen法制备大鼠脊髓损伤模型后,将DAPI标记的SKPs经局部注射(A组)、尾静脉(B组)、脑脊液(C组)移植到雌性大鼠体内。伤后第3天和第7天取材WesternBlot检测损伤局部趋化因子的表达,荧光显微镜观察和实时定量PCR法检测脊髓中SKPs含量。BBB法评价大鼠功能恢复情况。结果:SKPs具有很强的迁移能力。损伤局部趋化因子的表达上调,移植后第7天B组和C组脊髓SKPs数量较第3天时增加,但均低于A组;而伤后第7天B组和C组大鼠的功能恢复好于A组。结论:经静脉和脑脊液移植的SKPs可在损伤脊髓局部上调表达趋化因子的作用下迁移到损伤局部并存活,功能恢复优于局部注射法。

不同时相点移植的皮肤源性前体细胞在损伤脊髓中的存活数量及其机制

目的:观察不同时相点移植的皮肤源性前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)在损伤脊髓中的存活数量并探讨其可能的机制。方法:分离雄性大鼠SKPs,Allen法制备雌性大鼠中度脊髓挫伤模型,伤后即刻、1d、3d、7d和14d取损伤脊髓匀浆离心取上清液,酶联免疫吸附法测定上清液中白介素-1(IL-1)和血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)的含量,然后观察上清液、IL-1和PDGF对SKPs增殖和凋亡的影响。上述同样的时相点将DAPI标记的SKPs经局部注射到损伤脊髓处,移植后14d取材采用针对Y染色体的实时定量PCR检测脊髓中SKPs含量,BBB法评价大鼠功能恢复情况。结果:IL-1可抑制SKPs的增殖活性,促进其凋亡;而PDGF的作用相反。损伤3d后脊髓的提取液培养中IL-1的浓度最高,7d的PDGF浓度最高,7d的脊髓提取液对SKPs促增殖活性最高。伤后7d移植组损伤脊髓局部存活的SKPs数量最多,功能恢复也最好。结论:中度挫伤脊髓损伤后7d移植SKPs存活率最高,对功能恢复的作用最强,其可能机制与损伤脊髓局部表达的细胞因子有关。

皮肤源性前体细胞的生物学特性与临床应用

背景:皮肤源性前体细胞是一种神经嵴来源的前体细胞,具有多向分化潜能。目的:对皮肤源性前体细胞的培养分离、生物学特性以及临床应用前景作一综述。方法:应用计算机检索PubMed数据库2001-01/2011-01相关文献,以"skin-derived precursor cells,skin-derived precursors,SKPs"为检索词;共检索到文献137篇,最终纳入符合标准的文献36篇。结果与结论:皮肤源性前体细胞具有来源丰富、易于获取和多向分化的潜能等优点,能够分化为在体内外都有功能的Schwann细胞、骨样细胞和胰岛素样细胞等多种细胞类型。其在多种组织修复和疾病治疗,特别是神经损伤再修复中显示了良好的应用前景。但其研究仍存在一些问题,需要进一步深入研究。

胚胎干细胞源性神经前体细胞移植脑缺血大鼠局部细胞的免疫反应

背景:神经前体细胞的免疫原性各家研究结果不一,尤其是体内移植后的机体免疫反应模式需要进一步研究。目的:体外观察神经前体细胞组成型及诱导型主要组织相容性抗原表达情况;体内观察神经前体细胞移植入大鼠脑缺血组织后局部免疫细胞活化情况,探讨神经前体细胞的移植排斥可能性及模式。方法:自pCX-hrGFP ES-D3胚胎干细胞诱导分化神经前体细胞,流式细胞术体外检测主要组织相容性抗原Ⅰ,Ⅱ类分子表达及γ-干扰素诱导前后表达变化。实验分3组,磷酸盐缓冲液组、神经前体细胞组分别于大脑中动脉缺血大鼠模型造模后经侧脑室给予磷酸盐缓冲液注射及神经前体细胞移植,假手术组不造模。免疫组化法观察纹状区ED1+、CD4+、CD8+细胞浸润情况;淋巴细胞再刺激增殖实验观测神经前体细胞诱导移植大鼠颈部淋巴细胞的增殖指数。结果与结论:神经前体细胞组成型高表达主要组织相容性抗原Ⅰ类分子,几乎不表达主要组织相容性抗原Ⅱ类分子;经γ-干扰素诱导后,主要组织相容性抗原Ⅰ类分子进一步上调,主要组织相容性抗原Ⅱ类分子亦有轻度上调,提示神经前体细胞有可能引起机体免疫反应。移植实验表明,与假手术组相比,磷酸盐缓冲液组及神经前体细胞组均表现强烈的ED1+、CD4+、CD8+细胞浸润(P<0.05),说明脑缺血损伤本身能导致局部免疫细胞活化;神经前体细胞组比磷酸盐缓冲液组有更强的ED1+、CD4+细胞浸润(P<0.05),提示神经前体细胞移植可能导致局部免疫更进一步活化,且以CD4+T细胞反应为主。磷酸盐缓冲液组及神经前体细胞组神经前体细胞诱导下的增殖指数值均较假手术组升高(P<0.01),但前两组增殖指数值比较差异无显著性意义(P>0.05),提示脑组织局部炎症导致颈部淋巴细胞增殖性增加,而离体神经前体细胞不足以单独刺激致敏淋巴细胞增殖。

皮肤源性前体细胞的分离及其向神经系统细胞的诱导分化研究

目的:观察可否从截瘫病人皮肤中分离到皮肤源性前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)并诱导成神经系统细胞。方法:手术时从胸椎骨折伴或不伴截瘫病人切口边缘取2 cm^(2)皮肤,剪成1~2 mm^(3)碎片胰酶消化4 h。去除表皮层,吹打后过滤离心收集细胞进行培养。细胞荧光组织化学检测其细胞表型,并进行向神经系统细胞诱导分化。结果:成功地从截瘫病人皮肤中分离到SKPs,和非截瘫者相比其生物学特性无明显差异,均表达nestin等细胞表型,可被诱导为神经元和施万细胞。结论:可从截瘫病人皮肤分离SKPs并被诱导为神经系统细胞,提示其在脊髓损伤的自体细胞移植中具有良好的应用前景。

血清浓度对皮肤源性前体细胞在生物材料上增殖生长的影响

目的:探讨血清浓度对皮肤源性前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)在蝶翅及壳聚糖膜等生物材料表面增殖生长的影响。方法:采用酶消化法从新生大鼠背部皮肤分离纯化SKPs,将传代后的SKPs分别与具有不同表面结构的蝶翅和壳聚糖膜材料共培养,各组材料分别采用含有1%、5%、10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)浓度的培养基条件,培养4、24、48 h后以细胞活性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测各组材料上细胞活力,培养48 h采用倒置显微镜观察SKPs在材料上的贴壁和生长情况。结果:分离纯化的SKPs在各组材料上均能贴壁生长。在蝶翅材料上培养4、24 h后,CCK-8检测结果显示在含有1%FBS浓度培养基条件下SKPs的活力显著低于5%和10%FBS,培养48 h后倒置显微镜下观察,可见1%FBS条件下,细胞大量裂解出现碎片,5%和10%FBS培养条件下,SKPs均生长形态正常,两种蝶翅材料间差异无统计学意义。与蝶翅材料相似,SKPs在具有不同表面形貌的壳聚糖膜各组材料上培养,在1%FBS条件下各种表面形貌壳聚糖膜上SKPs的活力均显著低于5%和10%FBS,且培养48 h,细胞出现大量裂解碎片,5%和10%FBS下SKPs生长形态正常。结论:在具有表面微纳拓扑结构的生物材料上,1%低血清浓度不利于SKPs的生长,5%较低血清浓度可以满足SKPs细胞增殖生长的需要。

白细胞介素-6与脑源性神经营养因子对大鼠神经前体细胞向多巴胺神经元分化的诱导作用

目的:探讨细胞因子在体外诱导胎鼠纹状体神经前体细胞向多巴胺(dopamine,DA)神经元分化的机制,为临床上应用细胞移植替代治疗诸如帕金森病等神经精神性疾病提供理论依据。方法:分离获取胎龄14.5d的SD大鼠纹状体神经前体细胞,白细胞介素-6(IL-6)(10μg/L)和脑源性神经营养因子(BDNF)(50μmol/L)分别或联合对胎鼠纹状体神经前体细胞进行诱导。诱导2周后观察细胞的形态变化;免疫细胞化学染色检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)和酪氨酸羟化酶(TH)的表达,RT-PCR检测NSE、TH及转录因子Nurr1和Lmx1b mRNA的表达。结果:免疫细胞化学染色结果表明IL-6处理组、BDNF处理组及2者联合处理组均较对照组NSE和TH阳性率高,且IL-6和BDNF联合处理组较单用IL-6或BDNF处理组的细胞阳性率高(P<0.05);RT-PCR结果显示对照组仅有NSE的表达,而IL-6处理组、BDNF处理组及2者联合处理组均有NSE、Nurr1、Lmx1b和TH mRNA的表达。结论:IL-6和BDNF均可在体外诱导胎鼠纹状体神经前体细胞向DA神经元分化,并具有协同作用。

基于SKP-SCs来源的胞外囊泡构建的组织工程神经移植物的生物安全性评价

目的:评价基于皮肤源性前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)分化成的施万细胞(Schwann cells,SCs)来源的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)构建的组织工程神经移植物(tissue engineered nerve graft,TENG)的生物安全性。方法:将SKP-SCs来源的EVs(SKP-SC-EVs)注射至带有3根纤维支架的壳聚糖导管中制备成TENGs,修复比格犬坐骨神经40 mm缺损。术后6个月,取心、肝、脾、肺、肾、脑,通过HE染色进行形态学观察,并收集血液进行血液常规和生化指标分析,包括:白细胞、中性粒细胞、红细胞、血小板、总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶和血糖等。结果:形态学分析显示TENGs组比格犬的各脏器组织结构清晰,与自体移植组、壳聚糖导管组相比,各项血液指标差异均无统计学意义(均P>0.05),且未见毒性反应改变。结论:基于SKP-SC-EVs构建的TENGs植入比格犬体内具有良好的生物安全性,为临床应用TENGs治疗周围神经损伤提供安全性数据支持。

circMyt1l/rno-let-7d-5p/BDNF在少突胶质细胞前体细胞中的作用研究

目的:探讨circMyt1l/rno-let-7d-5p/脑源性神经营养因子(BDNF)在少突胶质细胞前体细胞(OPCs)中的表达变化和相互作用。方法:运用生物信息学分析方法,分析脑室周围白质损伤幼鼠脑组织中具有差异表达的circMyt1l,和其相互作用的miRNA和mRNA;分离培养出OPCs,将其分为对照组(Mock组)和氧糖剥夺(OGD)1、2、3 h组,即OGD1、OGD2、OGD3组,采用qRT-PCR法检测circMyt1l、rno-let-7d-5p基因表达水平,使用蛋白质印迹法检测BDNF蛋白表达水平。结果:生物信息学分析提示circMyt1l、rno-let-7d-5p、BDNF存在相互作用。OGD1、OGD2、OGD33组OPCs内circMyt1l的表达较Mock组均降低,差异均有统计学意义(P<0.01);而rno-let-7d-5p的表达较Mock组均升高,差异均有统计学意义(P<0.01);OGD1与Mock组间BDNF蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05),OGD2、OGD3两组与Mock组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:circMyt1l/rno-let-7d-5p/BDNF三者在OGD的OPCs中表达具有相互关系,circMyt1l表达的降低对rno-let-7d-5p的作用减弱,促进了其靶向BDNF的表达。

少突胶质前体细胞分离培养方法的改进及其谱系限定细胞体外分化模型的建立

目的对少突胶质前体细胞(OPCs)的分离、培养及传代方法进行改良,并建立少突胶质谱系限制细胞的体外分化模型,以模拟体内OPCs的发育过程。方法通过非特异性差异黏附法与A2B5-IgM抗体免疫筛选法结合,从胚胎大鼠脊髓来源的细胞悬液中分离、纯化OPCs,用含成纤维细胞生长因子-2和血小板源性生长因子的培养液作扩增培养;再以三碘甲状腺氨酸和神经营养因子-3诱导OPCs分化,最终分化为成熟的少突胶质细胞(OLs)。OPCs及其分化细胞的特性通过形态学观察和免疫化学染色法鉴定。结果 95%以上的细胞具有双极或三极突起的典型OPCs形态,并表达A2B5;在一定的培养条件下,OPCs可持续扩增和反复传代,且扩增的OPCs仍能维持其特有的形态和自我增殖的特性;进入分化进程的细胞将依次表达O4、O1、受体反应蛋白及髓鞘碱性蛋白等特异性分化抗原。结论分离的OPCs在形态、增殖以及分化格局等方面均与存在于胚胎脑区的O2A前体细胞(体内OPCs)相类似。

GDNF对PD模型大鼠黑质神经祖细胞和神经元前体细胞增殖及分化的影响

目的探讨胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)对帕金森病(PD)模型大鼠黑质内神经祖细胞和神经元前体细胞增殖和分化的影响。方法大鼠右侧纹状体内注射6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)建立模型,行为学分析筛选PD动物模型。将动物模型分为4组:动物模型对照组(右侧黑质内不注射);PBS组(右侧黑质内注射PBS);GDNF组(右侧黑质内注射GDNF);EGF+GDNF组(右侧黑质内注射EGF+GDNF)。动物继续存活21天。免疫组织化学染色方法检测黑质内酪氨酸羟化酶(TH)、Ⅲ型β-微管蛋白(Tuj1)、巢蛋白(Nestin)免疫反应阳性细胞,光镜下观察并进行细胞计数,统计学分析处理数据。用Western blot方法分析黑质TH、Tuj1、Nes-tin蛋白的表达,蛋白条带用图象处理仪扫描,用LabWorks软件分析处理。结果在GDNF组及EGF+GDNF组大鼠出现显著的行为学功能恢复的同时,其TH反应阳性神经元数量和TH蛋白表达均显著高于对照组,且能同时检测到这里有Tuj1反应阳性细胞及Tuj1蛋白表达。但仅在EGF+GDNF组检测到Nestin反应阳性细胞及Nestin蛋白表达。结论GDNF能促进PD模型大鼠黑质内神经元前体细胞向多巴胺能神经元方向分化。

诱导骨髓基质细胞表达神经细胞标记物Nestin，NSE和GFAP：脑源性神经节苷脂定向诱导细胞分化作用的研究

目的：研究脑源性神经节苷脂诱导成年大鼠骨髓基质细胞定向分化为神经前体细胞的作用。方法：成年大鼠骨髓基质细胞传 代纯化后，分别在无血清、无外源性生长因子、含2%B27的 Neurobasal-A 培养基及含20%胎牛血清的 DMEM 培养基中添加脑源性 神经节苷脂作为诱导物，观察细胞的形态变化。结果：在无血清、无外源性生长因子、含2%1327的 Neurobasal-A 培养基中，脑源性神 经节苷脂能诱导骨髓基质细胞定向分化为神经前体细胞，其形态发生显著变化，胞体逐渐变小、折光性增强，突起逐渐增多、延长，部 分细胞间可见突起连接、细胞核和核仁；诱导第5 d 免疫细胞荧光染色显示，神经前体细胞标记物Nestin染色阳性，同时部分细胞可 见神经元特异性标记物 NSE 及星形胶质细胞标记物 GFAP 染色阳性，而少突胶质细胞标记物 Nogo-A 染色阴性。在含20%胎牛血 清的 DMEM(高糖)培养基中，脑源性神经节苷脂的这种诱导、分化作用明显被抑制，表现为细胞形态变化不明显，Nestin、NSE 及 GFAP 染色均为阴性。两组对照组细胞形态无变化、上述染色均为阴性。结论：脑源性神经节苷脂具有诱导骨髓基质细胞成为神经 前体细胞的作用，这种作用不需要外源性生长因子存在，血清可抑制这种作用，脑源性神经节苷脂在成体干细胞可塑性研究中有重要 价值。

少突胶质前体细胞分离培养方法及其谱系限定细胞体外分化模型建立的改进

目的:对少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)的分离、培养及传代方法进行改良,探讨体外条件下OPCs的增殖与分化特性。方法:取新生SD大鼠脊髓来源的细胞分离、纯化OPCs行原代培养,用含碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)和血小板源性生长因子-aa(platelet-derived growth factor-aa,PDGF-aa)的培养液作扩增培养,MTT法检测OPCs的增殖能力;三碘甲腺原氨酸和睫状神经生长因子诱导OPCs分化,最终分化为成熟的少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs),并对分化细胞行形态学及免疫化学染色法鉴定。结果:95%以上的细胞具有双极或三极突起的典型OPCs形态并表达A2B5;MTT法检测显示OPCs在体外保持良好的增殖能力;细胞最终诱导分化为成熟的OLs并表达髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)。结论:OPCs在体外条件下可继续保持良好的增殖生长及定向分化能力。

牙源性干细胞的研究进展

牙齿再生是口腔领域的新挑战,牙源性干细胞的运用是牙齿再生的核心。目前已有一些牙源性和非牙源性干细胞及前体细胞被分离出来,并被用于牙齿再生方向的研究。这些干细胞有着不同的生物学特性及临床运用潜力,更好的了解这些干细胞各自特性和研究现状有助于对其进行深入研究和在牙齿再生中运用。本文重点就牙源性干细胞的研究进展情况进行综述。

兴奋性hiPSC源性类神经网络组织的构建

【目的】将人诱导多能干细胞源性神经前体细胞(hiPSC-NPCs)种植于去细胞视神经(DON)上,在体外构建一种具有突触传递功能的类神经网络组织,为神经组织损伤的修复提供一种有效途径。【方法】通过定向诱导和组织工程技术,联合应用hiPSCs和3D DON支架,构建一种新的类神经网络组织。定向诱导人诱导多能干细胞(hiPSCs)向人神经前体细胞(hNPCs)及神经元方向分化,使用免疫荧光染色鉴定细胞分化效率。制备3D DON支架,借助扫描电镜、Tunnel染色,鉴定支架形貌及细胞相容性。将诱导的hiPSC-NPCs种植于DON支架中,借助免疫荧光染色、扫描电镜、透射电镜和膜片钳对构建的类神经网络组织进行形态学观察和功能学鉴定。【结果】①免疫细胞化学染色结果提示,诱导的hiPSC-NPCs在体外大部分向神经元方向分化,成功构建了一种以神经元为主的神经网络。②扫描电镜和免疫组织化学结果提示,在体外成功构建了一种以兴奋性神经元为主的类神经网络组织。③免疫组织化学染色、透射电镜和膜片钳结果提示,构建的类神经网络组织能够传递兴奋性突触信息。【结论】利用天然来源的具有均匀孔道分布的DON生物支架材料和hiPSC-NPCs的有机结合,构建了一种以兴奋性神经元为主的具有突触传递功能的类神经网络组织,这种神经网络可作为脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)等神经组织损伤后组织替换疗法的有利工具,具有广阔的临床应用前景。

维甲酸联合Purmorphamine诱导皮肤源性前体细胞向运动神经元分化的研究

目的探索利用维甲酸（mtinoicacid，RA）和Punnorphamine（PM）诱导皮肤源性前体细胞（skin—derivedprecursors，SKPs）向运动神经元（motorneurons，MNs）分化，为运动神经元移植治疗失神经肌萎缩提供依据。方法从新生大鼠皮肤分离SKPs，进行培养、增殖，采用免疫细胞化学法检测SKPs标记物巢蛋白（Nestin）和纤维连接蛋白（Fibronectin）的表达。使用RA、PM作为诱导因子，诱导第3代SKPs细胞球向MNs分化；添加GDNF、BDNF等生长因子促使轴突延长，形成成熟的MNs。通过免疫细胞化学法检测MNs标记物HB9和胆碱乙酰转移酶（cholineacetyltransferase，ChAT）的表达，鉴定分化细胞是否为MNs，并计算ChAT、HB9阳性率。结果利用RA、PM诱导SKPs分化后的细胞具有MNs的形态，并表达其标记物HB9、ChAT。ChAT阳性率为（72．61±2．25）％，HB9阳性率为（75．16±3．62）％。结论利用RA、PM可诱导SKPs向MNs分化。