TRPA1传导皮肤角质细胞温热信息的机制研究

目的探究角质细胞中的温热信息是如何被传导至下游背根神经节(DRG)中的TRPA1离子通道。方法采用单细胞钙离子成像技术,利用TRPA1过表达系统以及野生型和TRPA1基因敲除小鼠,联合TRPA1激动剂(BITC)和抑制剂(HC-030031)检测H_(2)O_(2)在DRG神经元温热感知中的作用及其与TRPA1的相关性。在不同温热条件下培养皮肤角质细胞,并提取角质细胞RNA;采用RNA-seq分析比较不同温度培养的角质细胞基因表达异同,筛选皮肤角质细胞传导温热信息的候选因子。结果过表达TRPA1以及DRG神经元中的TRPA1均可在H_(2)O_(2)存在情况下被温热激活,而温热范围内不同温度可影响皮肤角质细胞中与H_(2)O_(2)产生有关的趋化因子配体2(CCL2)和核心蛋白聚糖(DCN)基因的表达。结论H_(2)O_(2)相关因子可能参与TRPA1介导的温热传导过程。

胰酶对皮肤角质细胞分离和传代的影响

考察不同的胰酶浓度及其作用时间对角质细胞分离和传代的影响。实验发现在胰酶浓度 0 2 5 %时作用5min可获得的总活细胞量和有克隆形成能力的细胞量均优于其它培养条件 ;而在胰酶浓度 0 0 5 %时作用 5min可获得最大的原代角质细胞贴壁率。随着胰酶浓度的提高 ,传代角质细胞的贴壁率和贴壁速率常数以及克隆形成率均随之增加 ,因此在传代培养时使用 0 2 5

抗氧化剂对皮肤角质细胞体外寿命的影响

考察了抗氧化剂对鼠角质细胞体外培养寿命的影响。实验发现在角质细胞的体外培养过程中添加抗氧化剂有利于延长细胞的寿命 ,其中效果最好的是巯基乙醇 ,其次为过氧化氢酶和SOD ,但在体外培养过程中 ,角质细胞生长速率仍然逐渐下降。实验还发现 ,添加抗氧化剂可在一定程度上提高角质细胞的克隆形成率 ,减缓细胞衰老速率。同时 ,通过考察鼠表皮角质细胞衰老动力学 。

腱抗原蛋白mRNA在皮肤角质细胞株中的表达及变异的意义

用逆转录酶／多聚酶链式反应（ＲＴ／ＰＣＲ）技术检测腱抗原蛋白（Ｔｅｎａｓｃｉｎ）ｍＲＮＡ在正常角质细胞和良、恶性角质细胞株（ＨａＣａＴ、ＳＣＬⅠ、ＳＣＬⅡ）中的表达。结果表明腱抗原蛋白ｍＲＮＡ在正常角质细胞不表达，恶性角质细胞株中高度表达，扩增条带为１３００ｂｐ，而良性角质细胞株具有弱表达。认为部分细胞有潜在的高增殖能力，可能与细胞生长特性改变有关。

皮肤镜和反射式共聚焦显微镜在角质形成细胞皮肤肿瘤中的应用

角质形成细胞皮肤肿瘤(KSC)是一类发病率逐年上升的肿瘤,与年紫外线辐射量直接相关,根据不同阶段可以分为光线性角化病(actinic keratosis, AK)、鲍温病(Bowen′s disease, BD)和侵袭性鳞状细胞癌(invasive squamous cell carcinoma, SCC)。KSC的诊断主要通过组织病理学确诊,但早期筛查以及后期随访,无创诊断显得尤为重要。皮肤镜(dermoscopy)和反射式共聚焦显微镜(reflectance confocal microscopy, RCM)属于在体观测皮肤表面以及表皮以下细微结构的无创诊断技术,在皮肤疾病诊断中具有极高的应用价值。本文主要总结并探讨KSC在皮肤镜和RCM下的表现特征以及皮肤镜和RCM在KSC的诊断、筛查和随访中的应用。

鞬抗原蛋白基因在皮肤良、恶性角质细胞株中的表达及其意义

用抗原蛋白（Ｔｅｎａｓｃｉｎ）基因探针及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术检测皮肤良、恶性角质细胞株（ＨａＣａｔ、ｓＣＬⅠ、ＳＣＬⅡ）中抗原蛋白ｍＲＮＡ表达水平。结果表明抗原蛋白基因在正常角质细胞及良性角质细胞株中不表达，而恶性角质细胞株中高度表达（７．８ｋｂ和６．２ｋｂ）。它们在恶性角质细胞中的特异表达，认为有助于判断角质细胞的良、恶性肿瘤，并可成为有关肿瘤的标记物之一。

叔丁基对苯二酚对皮肤角质细胞核因子Nrf2通路的影响

目的观察叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)对皮肤角质细胞核因子Nrf2(transcription factorNF-E2-related factor 2)及其调控的下游靶基因NAD(P)H醌氧化还原酶[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]和血红素单加氧酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)蛋白表达的影响。方法向HaCaT细胞中加入终浓度为50μmol/L的tBHQ溶液分别培养0(对照)、2、6、12、24、36 h;或分别加入终浓度为0(对照)、25、50μmol/L的tBHQ溶液培养24 h。采用western blot法检测细胞Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表达。结果与对照组比较,50μmol/L的tBHQ染毒2～36 h时HaCaT细胞Nrf2蛋白表达水平,染毒12～36 h时HaCaT细胞NQO1蛋白表达水平以及染毒6～36 h时HaCaT细胞HO-1蛋白表达水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。25μmol/L和50μmol/L tBHQ分别染毒24 h后HaCaT细胞的Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。与25μmol/L tBHQ染毒组比较,50μmol/L tBHQ染毒组Nrf2和HO-1蛋白表达水平均下降,NQO1蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 tBHQ能够诱导皮肤角质细胞的核转录因子Nrf2及其调控的下游靶基因NQO1和HO-1的蛋白持续表达,从而对皮肤角质细胞产生保护作用。

人皮肤角质形成细胞的胰蛋白酶消化分离及无血清培养

目的 探索用DMEM SF培养基对经胰蛋白酶两步消化分离的人角质形成细胞进行培养的方法和条件。方法 取临床整形外科手术后剩余皮肤 ,用 0 2 5 %的胰蛋白酶经冷和温两步消化分离后 ,用DMEM SF完全培养基于 5 %CO2 、37℃培养 ,绘制生长曲线 ,并用单克隆抗角蛋白抗体和鼠 IgG免疫组化试剂盒进行细胞鉴定。结果 用胰蛋白酶两步消化分离的角质形成细胞在DMEM SF培养基中可正常生长 2周以上 ,生长曲线显示细胞在第 4天进入对数生长期 ,第 10天进入停滞期。鉴定显示角质形成细胞占 95 %以上。来源于 3个不同个体的皮肤角质形成细胞经等量混合后培养与单独培养相比 ,细胞生长无统计学差异。结论 用胰蛋白酶对人皮肤进行冷和温两步消化分离的角质形成细胞 ,在DMEM SF完全培养基中生长状况良好 ,其他细胞污染少 ,实验成本低廉 ,操作简单。

黄芪多糖对中波紫外线辐射皮肤角质形成细胞损伤的影响

目的观察黄芪多糖对中波紫外线(UVB)辐射损伤皮肤角质形成细胞(Ha Ca T细胞)的影响,初步探讨其作用机制。方法采用UVB辐射Ha Ca T细胞进行造模。分为空白对照组、模型组、阳性对照组及黄芪多糖低、中、高剂量组,各药物组给予相应药物干预。MTT法测定细胞活力;生化比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量;ELISA检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)含量。结果与空白对照组比较,模型组SOD、CAT、GSH-Px含量降低,MDA、TNF-α、IL-6含量升高(P<0.05);与模型组比较,各药物组SOD、GSH-Px、CAT含量升高,MDA、TNF-α、IL-6含量降低(P<0.01)。结论黄芪多糖可在一定程度上减轻UVB对Ha Ca T细胞氧化应激性损伤。

藏雪莲多糖通过P38丝裂原激活蛋白激酶通路减轻中波紫外线辐射后皮肤角质形成细胞凋亡引起炎性损伤的研究

目的探讨藏雪莲(SSB)多糖是否通过P38丝裂原激活蛋白激酶(P38MAPK)通路减轻中波紫外线(UVB)辐射后皮肤角质形成细胞(Ha Ca T细胞)凋亡引起炎性损伤。方法 2014年10月—2015年3月,提取SSB多糖,体外培养Ha Ca T细胞,将Ha Ca T细胞分为低剂量辐射组(30 m J/cm2,辐射1 h,A组)和高剂量辐射组(60 m J/cm2,辐射1 h,B组);将A组和B组又分别分为对照组(1组)、辐射组(UVB,2组)、低剂量SSB多糖组(UVB+SSB 10 mg/ml,3组)和高剂量SSB多糖组(UVB+SSB 40 mg/ml,4组)。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测并比较白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、P38MAPK、P53、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关X(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)水平。结果 A2组IL-6、TNF-α、P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平高于A1组,Bcl-2水平低于A1组(P<0.05);A3组IL-6、TNF-α、P38MAPK、Caspase-3水平高于A1组(P<0.05);A4组TNF-α、Bcl-2水平高于A1组(P<0.05);A3组、A4组IL-6、TNF-α、P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平低于A2组,Bcl-2水平高于A2组(P<0.05);A4组IL-6、TNF-α、Caspase-3水平低于A3组,Bcl-2水平高于A3组(P<0.05)。B2组IL-6、TNF-α、P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平高于B1组,Bcl-2水平低于B1组(P<0.05);B3组IL-6、TNF-α水平高于B1组,Bcl-2水平低于B1组(P<0.05);B4组IL-6、Bcl-2水平高于B1组,TNF-α、Caspase-3水平低于B1组(P<0.05);B3组、B4组IL-6、TNF-α、P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平低于B2组,Bcl-2水平高于B2组(P<0.05);B4组IL-6、TNF-α、Caspase-3水平低于B3组,Bcl-2水平高于B3组(P<0.05)。结论 SSB多糖通过P38MAPK通路减少UVB辐射后Ha Ca T细胞凋亡,进而减轻Ha Ca T细胞的炎性损伤。

rhFGF-7对体外培养人皮肤角质形成细胞增殖的影响

目的建立一种人皮肤角质形成细胞分离和培养的方法,研究重组人成纤维细胞生长因子7(rhFGF-7)对人皮肤角质形成细胞增殖的影响。方法取环切术后包皮,分别用胰酶和dispaseⅡ酶消化法分离表皮,用无血清培养基进行无滋养层培养,采用免疫细胞化学方法对培养的细胞进行鉴定,并用细胞计数法测定细胞的生长曲线,MTT法检测rhFGF-7对人皮肤角质形成细胞增殖的影响。结果与胰酶消化分离表皮相比,dispaseⅡ酶消化获得的表皮,其细胞贴壁率高,增殖速度快,且成纤维细胞污染少;荧光显微镜下细胞胞浆呈黄绿色,为角蛋白阳性染色;培养的角质形成细胞可持续增殖至第8代,10ng/mL的rhFGF-7促角质形成细胞增殖作用最显著。结论所建立的人皮肤角质形成细胞分离和培养方法,可获得高纯度的人皮肤角质形成细胞,rhFGF-7可促进体外培养人皮肤角质形成细胞的增殖。

机械损伤对人皮肤角质形成细胞氧化应激和前列腺素E2分泌的影响

目的探讨机械损伤对人皮肤角质形成细胞前列腺素E2(PGE2)分泌的影响及其可能的机制。方法将体外培养的人皮肤角质形成细胞(HaCaT)分为损伤组、NADPH氧化酶(NOX)抑制剂氯化二亚苯基碘鎓(DPI)预处理组和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理组,三组细胞经划痕法建立体外机械损伤细胞模型,以未建模的HaCaT细胞作为对照组。于建模后不同时点收集损伤组、DPI预处理组和对照组的细胞及各组细胞的培养上清液,分别采用荧光探针技术和化学发光法测定细胞内活性氧(ROS)的生成和NOX活性,以酶联免疫吸附试验检测各组细胞培养上清液中前列腺素E2(PGE2)的质量浓度。结果建模后各时点,损伤组和DPI预处理组细胞内ROS生成和NOX活性均显著高于对照组(P<0.05或P<0.01);DPI预处理组建模后各时点细胞内ROS生成和NOX活性均显著低于损伤组(P<0.05或P<0.01)。各组细胞培养上清液中PGE2质量浓度的检测结果显示:建模后各时点,损伤组、DPI预处理组和NAC预处理组均显著高于对照组(P<0.01),DPI预处理组和NAC预处理组均显著低于损伤组(P<0.01)。结论机械损伤后人皮肤角质形成细胞的PGE2分泌量增加,其机制可能与细胞内ROS生成增加和NOX活性升高所介导的氧化应激有关。

皮肤角质形成细胞肿瘤中PCNA的表达及其与肿瘤转移的关系

目的 :探讨皮肤角质形成细胞肿瘤中增殖细胞核抗原 (PCNA)的表达及其与肿瘤转移的关系。方法 :用 ABC免疫组化技术观察48例皮肤鳞状细胞癌 (SCC)、41例基底细胞癌 (BCC)及 1 5例角化棘皮瘤 (KA)手术切除标本。结果 :PCNA在 SCC中的表达明显高于 BCC及 KA(P<0 .0 1 ) ,但其在 BCC与 KA中的表达差异无显著性 (P>0 .0 5)。 PCNA在低分化 SCC中的表达明显高于高分化者 (P<0 .0 1 ) ,但其表达在淋巴结转移组与无转移组之间的差异无显著性 (P>0 .0 5)。结论 :PCNA在 SCC、BCC及 KA中的表达差异有非常显著性 ;其表达与 SCC的分化程度有关 ,但与淋巴结转移似无关。

芥子气对人皮肤角质细胞DNA损伤效应的研究

目的探究芥子气对人永生化表皮角质形成细胞(HacaT细胞)DNA损伤的毒性作用特征及机制。方法采用CCK-8法检测不同浓度芥子气对HacaT细胞增殖的抑制作用,AnnexinⅤ-FITC法检测芥子气对HacaT细胞凋亡指数的影响,单细胞凝胶电泳法检测芥子气对HacaT细胞DNA的损伤,Western印迹法检测芥子气对HacaT细胞DNA损伤修复相关蛋白的影响。结果不同浓度芥子气作用HacaT细胞24 h后,对细胞的增殖均有抑制作用(P<0.05),并呈明显的剂量依赖性,其半数抑制浓度IC50值为121μmol/L;HacaT细胞的凋亡指数和彗星拖尾率随芥子气浓度的增加而增加;不同浓度芥子气染毒可导致DNA损伤修复相关蛋白表达量及活性的改变。结论芥子气对HacaT细胞具有明显的细胞毒性作用,可引起细胞凋亡并产生明显的DNA损伤,ATM-P53-γH2AX-PARP信号通路在芥子气导致DNA损伤修复过程中发挥重要作用。

体外培养对人皮肤角质形成细胞蛋白质组的影响

目的:探讨体外长期培养对人皮肤角质形成细胞蛋白质组的影响。方法:制备原代和第7代体外培养的人皮肤角质形成细胞的总蛋白样品进行双向凝胶电泳。采用PDQuest图像分析软件对获得的双向凝胶电泳图谱进行分析。串联飞行时间质谱鉴定选取的差异表达蛋白质点。半定量RT-PCR对差异表达蛋白质的mRNA水平进行确证。结果:获得了蛋白质分离效果较好的双向凝胶电泳图谱,串联飞行时间质谱鉴定选取的2个在第7代角质形成细胞中表达显著下调的蛋白质分别为PA-FABP(psoriasis-associated fatty acidbinding protein5)和Galectin-7,半定量RT-PCR确证第7代角质形成细胞中PA-FABP和Galectin-7的基因转录水平较原代角质形成细胞相应的基因转录水平显著降低。结论:体外长期培养人皮肤角质形成细胞可能影响一些与细胞的脂肪酸代谢及细胞凋亡相关蛋白的表达。

甘草酸对UVB诱导人皮肤角质形成细胞凋亡的影响

目的:研究甘草酸对UVB(中波紫外线)诱导人皮肤角质形成细胞(Ha Ca T细胞)凋亡的影响。方法:以不同浓度的甘草酸作用于Ha Ca T细胞,噻唑蓝比色(MTT)法筛选药物的有效安全浓度;用总剂量为30 m J/cm-2的UVB照射Ha Ca T细胞,制备光老化模型,MTT法检测细胞增殖率;流式细胞仪检测各组细胞总凋亡率;实时定量PCR(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Western Blot)法分别检测Caspase-3、Caspase-9 m RNA和蛋白表达水平。结果:1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸为最佳有效安全浓度。与空白组比较,UVB组细胞增殖率显著降低(P<0.01),细胞总凋亡率显著显著升高(P<0.01),Caspase-3、Caspase-9 m RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与UVB组比较,1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸+UVB组细胞增殖率显著升高(P<0.01),细胞总凋亡率显著显著降低(P<0.05,P<0.01),Caspase-3、Caspase-9 m RNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论:甘草酸能抑制UVB诱导的Ha Ca T细胞凋亡,其机制与其降低细胞总凋亡率,抑制Caspase-3、Caspase-9 m RNA和蛋白的表达有关。

皮肤角质形成细胞中TRPV1受体激活后的蛋白质组差异分析

目的研究皮肤角质形成细胞中辣椒素受体TRPV1激活后细胞中蛋白质组学的变化,并鉴定差异蛋白质。方法皮肤角质形成细胞株HaCaT细胞经辣椒素(CAP)刺激24 h后,提取蛋白样品,采用双向凝胶电泳技术分离HaCaT细胞总蛋白,用PDQuest软件分析对照组和CAP刺激组蛋白组图谱的表达差异点,再运用串联飞行时间质谱(MALDl—TOF.MS)鉴定差异蛋白。结果 CAP刺激HaCaT细胞后,磷酸甘油醛异构酶、烯醇化酶、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶和组织蛋白酶D蛋白表达水平增高,角蛋白14和60S酸性核糖体蛋白P2表达量降低,这些蛋白可能在TRPV1激活后影响细胞功能的过程中有重要作用。结论利用蛋白质组学技术,研究皮肤角质形成细胞株HaCaT细胞中TRPV1受体激活后蛋白表达差异,为研究TRPV1受体的作用机制,以及为研发针对性药物,提供新的线索和方向。

皮肤角质形成细胞的无血清培养方法

目的探索建立少量成年自体皮肤角质形成细胞体外无血清培养体系,为自体组织工程皮肤的构建与移植奠定物质基础。方法:无菌条件下,取2cm×2cm 兔耳皮肤组织块,Dispase 消化,分离真表皮,表皮以胰蛋白酶+EDTA 消化获得角质形成细胞,以含钙和不含钙的角质形成细胞培养液(K-SFM),按不同细胞密度接种于24孔板,观察细胞生长状况;免疫组化鉴定,MTT 法测定不同血清浓度对角质形成细胞增殖分化的影响。结果:在适当的 Ca^(2+)浓度下,少量自体角质形成细胞能够在无血清培养液 k-SFM 中培养扩增,最多可传4～6代。添加血清后可明显加速细胞分化。结论:无血清培养体系适用于少量成年自体角质形成细胞的体外连续培养扩增,培养的细胞可用于自体组织工程皮肤的构建。

Ⅳ型胶原与层粘蛋白在皮肤角质形成细胞肿瘤中的表达

目的 :探讨皮肤角质形成细胞肿瘤中 型胶原和层粘蛋白的表达及其与肿瘤转移的关系。方法 :用 ABC免疫组化技术观察 48例皮肤鳞状细胞癌、40例基底细胞癌及 1 5例角化棘皮瘤手术切除标本。结果 : 型胶原和层粘蛋白在高分化或无淋巴结转移的鳞状细胞癌中的表达明显高于低分化或有淋巴结转移者 (P<0 .0 1 )。基底细胞癌中 型胶原和层粘蛋白的表达类似于鳞状细胞癌 (P>0 .0 5) ,但其表达明显高于有转移的鳞状细胞癌 (P<0 .0 1 )。角化棘皮瘤中 型胶原和层粘蛋白的表达一般呈连续性 ,未见明显缺乏。结论 :皮肤癌的癌分化、淋巴结转移与

胺丁羟磷酸盐抑制皮肤角质形成细胞的增殖作用

目的 探讨胺丁羟磷酸盐(ALD)对皮肤角质形成细胞(KCs)增殖的影响及中间产物是否拮抗其影响。方法 一定浓度的ALD、甲羟戊酸(MVA)、胆固醇(CH)、法尼基焦磷酸(FPP)、香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)单独或联合处理KCs,细胞活力测定实验(MTS)法分析各处理组对KCs细胞增殖的影响;利用流式细胞术检测各加药组对细胞周期的影响;Western blot分析各加药组对细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、Cyclin E和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂(P21)及磷酸化的蛋白激酶B(pAKT)和磷酸化的胞外信号调节激酶1/2(pERK1/2)表达量的影响。结果 MTS实验表明ALD对KCs增殖有显著抑制作用,而上游产物MVA与其有协同效应;下游产物中仅CH有部分补救作用。流式细胞术检测结果显示KCs被ALD阻滞在细胞分裂间期G1期,而仅CH可减弱ALD导致的G1期阻滞。Western blot结果表明ALD显著下调Cyclin B1,同时上调Cyclin E和P21的表达。此外,ALD能促进磷脂酰基酶3-激酶-蛋白激酶B(P13K-AKT)信号通路,抑制丝裂原激活蛋白激酶-胞外信号调节激酶(MAPKS-ERK1/2)信号通路的激活。结论 ALD显著抑制原代KCs的增殖,CH对这种抑制有部分的补救作用。