大鲵皮肤cDNA文库构建及Arpc5l基因cDNA序列和组织表达分析

以健康大鲵背部皮肤为材料,采用Smart技术构建大鲵皮肤cDNA文库,经检测文库容量为1.50×106cfu,文库重组率为98%,插入片段平均长度约为1 kb.通过对大鲵皮肤cDNA文库的随机筛选,分离获得了大鲵肌动蛋白相关2/3复合物亚基-5样蛋白(Arp2/3 complex subunit 5-like,Arpc5l)基因cDNA序列.生物信息学分析表明,大鲵Arpc5l基因全长cDNA为699 bp,包含459 bp的开放阅读框,分子量为17 154.36,等电点(pI)为5.43;该基因编码的Arpc5l蛋白分别在7-29 AA处和44-66 AA处具有跨膜结构域及多种二级结构,且三级结构与Arp2/3 complex家族成员相似.实时定量PCR结果表明,该基因在大鲵皮肤、肌肉、肠、肝、脾、肺、胃以及肾等组织中广泛表达,且在肾、肠、肌肉中的表达量极显著高于其它组织(P<0.01).进化分析结果表明,大鲵Arpc5l氨基酸序列和小鼠(77%)等陆生动物同源性最高,和爪蟾同源性为73%,大鲵处于水生到陆生之间的过渡类型,且与陆生动物的亲缘关系更近.

大鲵皮肤cDNA文库ESTs分析及Dynll 2基因的分离与表达

以本实验室构建的大鲵皮肤cDNA文库为材料,通过文库质量检测、随机测序、ESTs拼接、COG软件进行基因注释等对文库进行了分析,并从中分离获得了大鲵胞质动力蛋白轻链2(dynein light chain,LC8-type 2,Dynll 2)基因的cDNA序列,对Dynll 2基因进行了生物信息学分析及组织表达研究。结果表明,本实验室构建的大鲵cDNA文库初级库容为1.50×106 cfu,文库重组率为94.8%,插入片段平均长度约为1 kb。400个随机克隆测序共获得343个有效ESTs,其中214条ESTs序列E-值<10-6,经COG软件归为9大类,其中与分泌蛋白、细胞代谢、细胞骨架以及信号转导相关的基因表达量最高,分别为31.3%、14.0%、13.0%和12.6%。表明大鲵皮肤分泌活动强烈,代谢旺盛,这和大鲵皮肤发挥免疫、呼吸以及渗透压平衡等生理功能相一致。获得的大鲵Dynll 2基因全长为682 bp,其中5'-UTR为57 bp,3'-UTR为313 bp,生物信息学分析表明,该基因编码104个氨基酸,分子量为12.03 ku,等电点pI值为7.05。Dynll 2蛋白在88～104处有由里向外和由外向里的2个跨膜螺旋区,且二级结构以α—螺旋为主;在69～87处有典型的"ZnF-C2H2"结构模体;经比较,其三级结构与鼠Dynll 2蛋白相似。Dynll 2蛋白的进化分析表明,大鲵与无尾两栖类相比,更接近陆生动物。荧光定量实验表明,大鲵Dynll 2基因在肌肉中高表达,在其他组织中低度表达。

山羊痘病毒毒力因子KLP1互作蛋白的筛选与初步鉴定

为进一步研究山羊痘病毒毒力因子KLP1,了解其生物学功能,本试验构建了羊皮肤组织酵母cDNA文库及GTPV KLP1蛋白基因的诱饵质粒,并做了质粒的自激活检测。采用酵母双杂交方法,从羊皮肤组织酵母cDNA文库中筛选出与KLP1蛋白相互作用的蛋白,结果成功构建了羊皮肤组织cDNA文库,容量为1.05×10^(7) CFU,成功构建pGBKT7-KLP1诱饵质粒,且在酵母双杂交系统中没有毒性和自激活作用;酵母双杂交筛选出与KLP1蛋白互作的蛋白克隆25个,经过测序比对合并得9种蛋白,对其进行LacZ回转验证和共定位试验验证,证实NOTCH1蛋白与KLP1蛋白具有特异的相互作用。本试验为阐明GTPV毒力因子KLP1的生物学特征及其作用机制提供参考。