毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白

建立了用毕赤酵母表达系统表达皮蝇素A（Hypodermotin A，HA）的技术，并对表达条件进行了优化筛选。将皮蝇素A基因连接到质粒pPIC9k上，构建了重组转移质粒pPIC9k—HA。重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115后，用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选。重组酵母细胞在含0．5％甲醇的培养基中诱导产生目的蛋白，培养3d后收取上清，用阴离子交换层析柱分离纯化。经SDS—PAGE检测，所表达的蛋白相对分子质量约为30000。Western—blotting表明，该蛋白能与兔抗HA血清特异性结合。明胶电泳检测显示，该蛋白具有酶活性。单因素改变表达条件的结果表明，甲醇浓度在0．5％～1％、溶氧量在70％以上、诱导2～3d的情况下表达产量最高，达1500mg／L左右。该研究结果对防治牛皮蝇蛆痛疫苗的深入研究及毕赤酵母在寄生虫领域的应用有一定价值。

皮蝇素A基因的克隆及其毕赤酵母表达载体的构建

提取采自甘肃玛曲皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出皮蝇素A(Hypodermin A,HA)基因片段,用XhoⅠ、XbaⅠ消化,将消化后的目的基因HA纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的载体pPICZa连接并转化,获得重组表达质粒pPICZa-HA,经PCR、酶切、测序表明,目的基因插入位置、方向和阅读框正确。

重组牛皮蝇素A蛋白的免疫试验

用由毕赤酵母表达的皮蝇素A(Hypderm in A,HA)蛋白分别免疫新西兰大白兔和牦牛,了解该蛋白免疫效果。用两种不同分子量的重组HA蛋白分别免疫新西兰大白兔1次和2次,ELISA测其抗体消长规律。结果表明,3周后抗体水平达到峰值,后缓慢下降。50KD蛋白免疫效果较30KD蛋白好,差异非常显著(P<0.01)。用其中50KD的重组HA蛋白分别在7月和9月免疫自然感染牛皮蝇蛆病牦牛,观察感染率和感染强度,ELISA测其抗体消长规律。结果表明,7月免疫组与9月免疫组感染率分别为83.3%和36.3%(对照组为55.5%);平均感染强度分别为6.5和4.2(对照组为13.0),差异不显著(P>0.05)。免疫后,抗体水平上升,3个月后缓慢下降。9月免疫组免疫效果较7月免疫组好,三组抗体水平差异非常显著(P<0.01)。上述研究结果为防治牛皮蝇蛆病疫苗的深入研究和实践运用提供了参考依据。

皮蝇素A基因DNA疫苗的构建及其免疫特性研究

本研究以实验室保存的原核表达载体pET-HA为模板,PCR扩增皮蝇素A(HA)基因,将克隆基因插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中构建DNA疫苗pcDNA-HA。构建的DNA疫苗pcDNA-HA和空载体pcDNA3.1(+)体外转染小鼠胎儿成纤维细胞,间接免疫荧光试验检测细胞内目的基因的表达。将pcDNA-HA、空载体pcDNA3.1(+)和PBS免疫BALB/c小鼠后,对免疫小鼠的体液免疫水平进行了检测。结果表明,构建的DNA疫苗能在小鼠胎儿成纤维细胞中表达,能被抗HA抗体识别,可诱导小鼠产生特异性体液免疫反应,说明HA可作为牛皮蝇蛆病的候选疫苗抗原。本研究为牛皮蝇蛆病的DNA疫苗研究奠定了基础。

牛皮蝇素A通过诱导CD4^+CD25^+Treg细胞生成诱导免疫耐受

器官移植作为治疗器官衰竭终末患者的一种有效方法,在临床中得到广泛应用。但由于免疫排斥反应的存在,移植物的存活率一直得不到保障。此外,免疫抑制药物仍然存在效果不佳,毒副作用较大等缺点。寄生虫通过抑制宿主免疫排斥反应,达到在宿主体内长期生存的机制,为免疫抑制药物的研发提供新的思路。牛皮蝇素a(ha),是由牛皮蝇幼虫分泌的一种丝氨酸蛋白酶,是其诱导免疫抑制的主要蛋白。深入揭示其免疫抑制机理,将为其应用与器官移植后的免疫耐受诱导提供新的方法与思路。本研究中我们发现ha的免疫抑制机理与其促进Cd4^+Cd25^+Treg细胞的生成相关,揭示了ha新的免疫抑制机理。