皱皮香猪WIF1基因结构变异WIF1-I8-sv889的研究

为探究WIF1(Wnt inhibitory factor 1)基因中WIF1-I8-sv889结构变异位点变异与皱皮香猪躯干被毛形成的关系,本试验采用冰冻组织切片观察皱皮香猪皮肤毛囊的组织学形态,采用PCR方法分析WIF1-I8-sv889位点在猪群中的分布频率,并通过在线软件UCSC、RegRNA 2.0对结构变异序列所含的功能元件进行分析。组织学研究显示,与正常香猪和大白猪皮肤相比,皱皮香猪毛囊毛根鞘伸入真皮层,形成棘突,且皱褶凹陷处毛囊聚集,相反皱褶凸起处毛囊较少;皱皮香猪皮肤毛囊中的毛球宽度显著增大(P<0.05),单个毛囊中的毛干数极显著增多(P<0.01)。在WIF1-I8-sv889结构变异断点两端设计特异性引物,扩增片段长1 383 bp,与参考基因组比,1383 bp中889 bp为结构变异区间,缺失581 bp,倒置308 bp。群体分布结果显示,猪群中WIF1-I8-sv889位点呈现出丰富的多态性,检测到3种基因型:正常的II型、杂合的DI型和缺失的DD型,皱皮香猪中未检测到II型;与正常香猪和大白猪相比,皱皮香猪中D等位基因占优势(94.44%);经卡方检验,皱皮香猪D等位基因显著或极显著高于正常香猪和大白猪(P<0.05;P<0.01)。结果提示,WIF1基因中的WIF1-I8-sv889结构变异可能与皱皮香猪毛囊的形态发生有关。

皱皮香猪3个基因组拷贝数变异的多态性分布

为探究皱皮香猪个体产生皮肤变异的根本原因,本文基于重测序数据,采用生物信息学分析皱皮香猪基因组中的拷贝数变异(CNV),通过荧光定量 PCR 方法检测皱皮香猪中 3 个 CNVs 的拷贝数变异规律,并与香猪和大白猪进行比较。结果表明:3 个 CNVs 在猪群中的拷贝数变异呈现出多态性变化,皱皮香猪中CNV1以拷贝数缺失型为主,其中的 MPC1和 RSK3基因可能与脂肪沉积有关;皱皮香猪 CNV2和 CNV3以拷贝数增加型占优势,其中的 CCL17和 CX3CL1基因参与皮肤等组织的炎症反应,可能通过剂量效应引起香猪皮肤产生褶皱。

皱皮香猪HAS 2基因SNPs的鉴定及生物信息学分析

为了探究皱皮香猪全身性皮肤褶皱是否与透明质酸合成酶2(hyaluronan synthase 2,HAS 2)基因变异有关,本研究以普通香猪为对照,采用特异性PCR方法克隆HAS 2基因的外显子编码区,应用生物信息学方法分析测定基因编码区的碱基变异,检测变异位点在群体中的分布频率。结果显示,皱皮香猪HAS 2基因中检测到4个SNPs位点:位于外显子1的T221A错义突变(导致亮氨酸替换为赖氨酸)和A228G同义突变,位于外显子2的T183C和外显子4的C537T同义突变。生物信息学分析发现,T221A和A228G位点构成4种单倍型,其中T-A为皱皮香猪群体的主要单倍型(27.5%),且在皱皮香猪群体中紧密连锁(r^(2)=0.253),而且T221A和A228G突变可引起mRNA自由能和蛋白质结构发生变化,TA组合的自由能为-573.29 kJ·mol^(-1),TG组合的自由能为-580.89 kJ·mol^(-1),AG组合的自由能为-572.66 kJ·mol^(-1);AA组合的自由能为-571.03 kJ·mol^(-1);蛋白序列中亮氨酸替换为赖氨酸后,α螺旋由35.52%降为32.97%,自由卷曲由43.17%升至44.51%,同时引起蛋白序列三级结构的改变。位点T221A和A228G在香猪群体中呈现出丰富的多态性,均表现出3种基因型;关联分析结果显示,皱皮香猪T221A位点的A等位基因频率显著高于普通香猪(P<0.05),A228G位点中皱皮香猪的G等位基因频率极显著高于普通香猪(P<0.01)。T183C位点的C等位基因频率和C537T位点的T等位基因频率在皱皮香猪和普通香猪间未达到显著性差异(P>0.05)。研究结果揭示,HAS 2基因的外显子1中发生的两个碱基变异可能影响基因转录后mRNA的稳定性以及蛋白的三维结构,影响HA的合成量,并与皱皮香猪体侧皮肤不均匀增厚且发生褶皱有关。