警惕茄斑驳皱缩病毒入侵

茄斑驳皱缩病毒(eggplant mottled crinkle virus)是一种严重威胁茄子(Solanum melongena)、辣椒(Capsicum annuum)、天竺葵(Pelargonium hortorum)、梨(Pyrus communis)等的番茄丛矮病毒属(Tombusvirus)病毒,在日本、印度、意大利、中国台湾等地均有发生,可导致严重减产,而我国大陆尚无发生报道。本文概述了该病原物的分类地位、传播方式及检疫措施,并提出我国相应防疫策略。

草莓皱缩病毒（SCV）外壳蛋白抗原表位的预测、编码片段的克隆及表达

应用生物信息学软件DNAStar、DNAMAN及Bepipredi线性表位预测（http：//tools.immu nee pitope.org/tools/bcell/iedb-input）在线工具对草莓皱缩病毒（Strawberry Crinkle Virus，SCV）78kDa外壳蛋白的氨基酸序列进行了分析，选择了一段抗原表位预测较强的27氨基酸残基的区段（S3）。依据大肠杆菌的密码子偏好性化学合成了编码S3区段的DNA片段并克隆至大肠杆菌表达载体pET32a（＋）中，序列分析确定了含正确插入片段的重组质粒pET32a（＋）-S3。转化上述重组质粒至大肠杆菌菌株BL21（DE3）中并诱导重组蛋白表达。表达产物经SDS-PAGE分析表明，受IPTG诱导表达的重组蛋白与所构建的重组蛋白的分子量一致。

茄子斑驳皱缩病毒病病原物的鉴定及分子进化分析

为了鉴定引起茄子斑驳皱缩病毒病的病原物,利用siRNA高通量测序技术(Small interfering RNA,siRNA),结合生物信息学的方法发现2个表现斑驳和皱缩的茄子样品中存在蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus,BBWV2)、葡萄A病毒(Grapevine virus A,GVA)和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)。采用RT-PCR技术对该结果进行验证,2个样品中均检测到BBWV2和TMV,未检测到GVA。通过对BBWV2外壳蛋白(Large coat protein,LCP)大亚基基因进行测序和分子进化分析,获得了2条1126 bp的BBWV2 LCP基因片段,2条BBWV2 LCP基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列一致性分别为99.6%和99.3%;与NCBI中已发表的23个BBWV2 LCP基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列一致性分别为79.9%~95.2%和80.5%~97.2%。基于LCP基因核苷酸序列进行种群结构和遗传多样性分析,结果表明在系统发育进化树中,BBWV2可分为两大支。不同寄主BBWV2 LCP基因的遗传距离在0.049~0.332。

芜菁皱缩病毒P38蛋白的原核表达及抗血清的制备

从感染芜菁皱缩病毒(TCV)的拟南芥中提取总RNA,通过反转录PCR(RT-PCR)扩增得到TCV的外壳蛋白基因P38.在目的基因ORF框两边引入酶切位点BamHⅠ和SacⅠ,并连接到表达载体pET30-a上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中,37℃经0.5mM/L IPTG诱导6h后获得了分子量约为48kD的融合蛋白.经Ni-NTA纯化目的蛋白,注射大白兔制备抗血清.Western blot结果表明制备好的抗血清能成功检测感染TCV的拟南芥.

三七皱缩型病毒病发生规律调查研究

为探明三七皱缩型病毒病的发生规律,采取系统调查法开展了历时3年的调查。结果表明：三七皱缩型病毒病在三七整个生长期均可发生,表现出波浪式起伏、峰值多、峰期历时长的特点。高峰期出现时间、数量及峰值的大小因七龄及各年气候条件的不同而不同,峰值通常出现在4月下旬、5月中旬至5月下旬、6月下旬至7月下旬、8月、9月中旬至9月下旬、10月、11月中旬至12月上旬,同龄七不同年可因气候变化而有所前移或后延10～15 d;高龄七病情明显重于低龄七。建议根据皱缩型病毒病发生规律,生产上从选育无病种子、种苗入手,注重对媒介昆虫的控制,加强田间管理,以避免或减轻病毒病的发生危害。

三七皱缩型病毒病与环境因子的关系研究

采用平行线取样法,调查不同海拔、地势、前作、荫棚材料及荫棚透光率等环境条件下种植三七的发病情况,揭示三七皱缩型病毒病与环境因子关系。结果表明院三七皱缩型病毒病的发生与海拔、地势、前作、荫棚材料及荫棚透光率等环境条件有关,适宜病害发生的环境条件如下院海拔1 410~1 600 m、地势45°以下缓坡地或平地,前作玉米、花生;荫棚材料杉树叶;荫棚透光率11%~20%。根据调查结果,建议三七园选地避免不利环境,改善三七生长环境,使之达到不利于病毒病的发生和发展,有利于三七生长的目的。

草莓病毒病的防治

目前已知草莓病毒多达数十种，其中我国草莓病毒病主要由4种病毒引起，即草莓斑驳病毒、草莓镶脉病毒、草莓皱缩病毒、草莓轻型黄边病毒。现将其防治方法介绍如下：

BAK1在减弱拟南芥对Turnip crinkle virus感病性作用中的影响

以Turnip crinkle virus(TCV)-拟南芥(Col-0)为互作系统,研究了跨膜蛋白BAK1是否参与拟南芥对TCV的防御作用。接种试验结果表明,bak1-4突变体对TCV更加敏感,叶片易褪绿枯萎;而过量表达植株在接种TCV后受损程度较小。H2O2检测表明,严重的病症伴随有较多活性氧积累,提示该亲和互作系统中,活性氧有利于症状的形成,BAK1对活性氧产生有负调控作用。半定量RT-PCR分析表明,BAK1过表达有利于MAPK途径下游与防御相关MPK和WRKY转录因子的激活;但不影响与病程相关水杨酸途径PR1和PR2基因的表达,它们没有介导对TCV的抗性。

草莓脱毒与繁殖技术

草莓是果树中结果快、成熟早、株体小、繁殖易、周期短、效益高的经济植物。由于草莓是草本植物,长期靠匍匐茎繁殖,易发生病毒病感染。据报道,在我国草莓主栽区有4种病毒,总侵染率为80%,其中单独病毒侵染率为41.6%,两种或两种以上病毒复合侵染率为38.6%。这4种病毒为草莓轻型黄边病毒、草莓镶脉病毒、草莓皱缩病毒和草莓斑驳病毒。为提高草莓的产量和质量,笔者对草莓病毒病的为害、脱毒方法、繁殖技术进行研究,现介绍如下:1 草莓病毒病及其为害1)草莓斑驳病毒。单独侵染时往往不表现明显症状,但病株长势衰退,果实品质下降,可减产20%～30%,与其他病毒复合侵染时可产生斑驳症状。2)草莓轻型黄边病毒。单独侵染时无明显症状,仅使病株轻微矮化,对产量影响不大。

CLCrV介导的VIGE体系承载力的研究

探索CLCrV介导的VIGE体系的承载力。通过CLCrV介导的sgRNA投送系统将基因编辑载体注射过表达Cas9的棉花,提取棉花基因组DNA,利用PCR/RE的方法筛选有效的sgRNA。然后利用同样的方法来检测CLCrV介导的VIGE体系的承载力。基于棉花GhBsr-k1基因成功构建了6个基因编辑载体,其中2个基因编辑载体实现了对棉花GhBsr-k1基因的靶向编辑;将完整的基因编辑载体元件构建到CLCrV病毒载体上并没有检测到棉花细胞中发生基因编辑。针对棉花GhBsr-k1基因,筛选到两个有效的sgRNA。但承载整个CRISPR/Cas9系统的CLCrV载体难以在棉花叶片中实现有效的基因编辑。

基于Csy4与MCP的新型迷你基因组编辑系统的构建

MCP是MS2噬菌体的外壳蛋白,Csy4是一种参与CRISPR 1-F系统crRNA生成的小型蛋白,能够以较高的特异性识别并结合RNA。目前CRISPR/Cas等基因组编辑技术存在靶向核酸酶分子量大、脱靶率高、受PAM位点限制等问题,为解决上述问题,构建基于上述两种小型蛋白的新型迷你基因组编辑系统。本研究采用AlphaFold2预测MCP-FokI、FokI-MCP、Csy4-FokI和FokI-Csy4融合蛋白的结构,通过浸花法将MCP-FokI和FokI-MCP编辑载体分别转化拟南芥,利用拟南芥叶片注射的方法投送CLCrV介导的Csy4-FokI与FokI-Csy4编辑系统,提取拟南芥基因组DNA,通过HI-TOM高通量测序检测新型迷你基因组编辑系统的编辑能力。结果显示,融合蛋白中MCP、FokI和Csy4都各自保持着自身原有的三维结构,预示它们都能正常发挥彼此的功能。构建靶向敲除拟南芥CLA1基因的4个不同中间间隔区的双靶位点MCP-FokI和MCP-FokI植物表达载体,初步证明MCP-FokI和FokI-MCP均不能实现对靶基因的靶向编辑。构建靶向敲除拟南芥CLA1基因的7个CLCrV介导的不同中间间隔区的双靶位点Csy4-FokI编辑载体,其中CLCrV介导的Csy4-FokI编辑系统能够实现对靶基因的靶向编辑,但是突变类型均为碱基置换类型且编辑效率很低,而FokI-Csy4基因组编辑体系并未检测到编辑的发生。成功构建了Csy4-FokI新型迷你基因组编辑系统,为克服CRISPR/Cas基因组编辑技术存在的问题提供了一种新的解决方案。

草莓主要病害及防治

一、病毒病 1.病害症状 草莓病毒病主要有草莓皱缩病毒、黄边病毒、斑驳病毒、镶脉病毒。草莓病毒病具有潜伏侵染性,单一病毒侵染一般不表现或轻度表现症状,

重茬草莓病害综合防治措施

草莓的病害种类很多，有黄萎病、根腐病、灰霉病、叶斑病等，其中为害最大的是病毒病和线虫病。草莓病毒病在我国普遍发生的有4种：草莓斑驳病毒、草莓皱缩病毒、草萄弱黄边病毒和草莓镶脉病毒。这4种病毒分别通过蚜虫、线虫、嫁接等方式传播，在栽培品种中一般症状不明显，受害时草莓生长严重退化，植株的生长势弱，矮化，结果数量少，果实小，产量低。

落葵皱缩花叶病毒CP基因的原核表达及多克隆抗血清的制备

以感病紫茉莉叶片为材料,采用RT-PCR方法克隆落葵皱缩花叶病毒(Basella rugose mosaic virus,Ba RMV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,并构建p ET30a-Ba RMV-cp原核表达载体。将原核表达载体转化大肠杆菌[Rosetta(DE3)Plys S],成功诱导表达得到大小约为40.0 k D的与预期大小相符的融合蛋白(His-CP)。SDS-PAGE电泳完毕后用0.25 mol·L^(-1)的KCl溶液染色,将目的蛋白切胶纯化后免疫新西兰大白兔,制备抗血清。间接酶联免疫吸附法(ID-ELISA)检测该抗体的效价为1︰16 000,Western-blotting分析表明该抗体具有很强的特异性。对野外感病紫茉莉和实验室内接种发病本氏烟检测结果也表明,所制备的抗体具有良好的特异性,可用于大规模样品检测。