盐胁迫下短芒大麦cDNA文库的构建

为了克隆与研究盐胁迫相关的基因,以盐胁迫后的短芒大麦叶片为材料,用Trizol一步法提取总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA和第二链cDNA.cDNA纯化后,与λZAP表达载体连接,体外包装后得到盐胁迫下短芒大麦cDNA文库,其重组率达96%,滴度为2×107 pfu/mL,插入片段长度0.5～3.0 kb.

盐胁迫下胡杨cDNA文库的构建及其nhx基因的克隆

采用CTAB法提取经600mmol.L-1NaCl胁迫处理后的胡杨总RNA,利用SMART技术构建载体为λTriplEx2的盐胁迫条件下胡杨的表达型cDNA文库(SSL)。文库的滴度为1.2×106pfu.ml-1,重组率约为90.6%,扩增后的滴度为3×109pfu.ml-1,容量约为2.4×1011。插入片段长度均大于400bp,平均长度约为790bp。从文库中随机挑选32个阳性克隆进行3′端测序,并将测序结果通过NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库进行比较,发现有23个EST序列与已知序列有明显的同源性,而其余的与NCBI中的已知序列相似性较低(e值>10-4),可能是未知基因。其中序列SSL061、SSL179与脱水素序列有较高的序列一致性。同时合成引物,通过PCR扩增文库的方法,从中筛选获得存在于植物细胞膜上并在植物受盐胁迫时起重要作用的nhx基因,进一步验证了文库的质量。

小麦苗期盐胁迫72h cDNA文库的构建及质量检测

以98-160盐胁迫72h叶片的mRNA为起始材料，采用SMART技术构建了一个高质量的cDNA文库，经检测，未扩增文库的滴度为3．44×10^6pfu／mL，白斑率〉85％，插入片段多数在0．5～1．5kb，有的可以达到2kb，平均长度为800bp．因此，按照此方法构建的是1个高质量的cDNA文库，可有效地用于下一步全长基因的筛选和克隆．

盐胁迫诱导的棉花叶片细胞程序性死亡

为明确盐胁迫是否可以诱导棉花叶片发生细胞程序性死亡,用0.5%的NaCl溶液对棉花叶片进行胁迫处理,在DNA琼脂糖凝胶电泳图谱上观察到明显的DNA拖尾现象,即NaCl处理诱发了DNA核小体间的断裂,从而表现出典型的细胞程序性死亡的生化特征。表明NaCl诱导棉花叶片死亡过程中,存在一个明显的细胞程序性死亡阶段。

观音竹盐胁迫均一化全长cDNA文库的构建与EST测序分析

将DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术与SMART(switching mechanism at 5'end of RNA transcript)建库技术相结合,构建观音竹(Bambusa multiplex var.riviereorum)盐胁迫幼叶的均一化cDNA文库.经检测该原始文库滴度为1.7×106 cfu.mL-1,文库重组率达97%,插入片段的平均长度为1.5 kb.同时对文库中随机的600个单克隆进行测序,获得543个非重复序列,包括30个片段重叠群和513个单基因;文库冗余率为5.4%.表明观音竹盐胁迫幼叶均一化全长cDNA文库构建成功.

盐生植物海马齿盐胁迫全长cDNA文库的构建与分析

为了研究盐生植物耐盐基因表达调控,本实验以海水浇灌的海马齿植株为供试材料,构建了盐胁迫下的全长cDNA文库。构建方法如下:采用改良的CTAB法提取总RNA,SMART法反转录合成cDNA,LD-PCR方法合成双链cDNA。LD-PCR产物经蛋白酶K消化和SfiⅠ酶切后,经CHROMA SPIN+TE-1000分离柱子除去小片段DNA后,回收0.5kb以上的片段,按照适当的比例连接λTripIEX2载体。连接产物利用MaxPlaxTMLambda Packaging Extracts进行体外包装,得到海马齿初级cDNA文库。初始文库的独立克隆数为2.4×106pfu,初级文库滴度大于4.80×106pfu/mL,重组率为93.75%,插入片段为0.5～5kb,扩增文库的滴度为1.21×109pfu/mL,所得文库质量较高。本研究表明该cDNA文库适合于盐生植物海马齿相关基因的克隆和分析。

盐地碱蓬叶片液泡膜H^＋—ATPase B亚基的克隆及盐胁迫下表达分析

植物液泡膜H^+-ATPase在建立跨液泡膜质子梯度、促进液泡Na^+区域化、提高植物耐盐性方面发挥着重要作用。本实验从盐生植物盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)cDNA文库分离到碱蓬叶片液泡膜H^+-ATPase B亚基cDNA克隆。测序表明该基因长达1974bp，开放阅读框有1470bp编码489个氨基酸，含有一个保守的ATP结合位点，其蛋白分子量约为54．29kD。Northern及Western印迹表明盐地碱蓬液泡膜H^+-ATPase B亚基表达明显受NaCl胁迫诱导，并且在NaCl胁迫下，B亚基在转录及翻译水平上与液泡膜H^+-ATPase c亚基存在协同作用。盐胁迫下，盐地碱蓬液泡H^+-ATPase B亚基与c亚基的协同表达增加了液泡H^+-ATPase的数量，从而提高了液泡H^+-ATPase活性，为碱蓬叶片液泡Na^+区域化提供了动力，最终提高了碱蓬植株的耐盐性。

盐胁迫下大麦酵母双杂交文库的构建与鉴定

为研究盐胁迫下大麦耐盐相关蛋白的互作蛋白,利用Gateway技术构建盐胁迫下大麦的酵母双杂交文库。首先提取受盐胁迫的大麦总RNA,分离mRNA并合成双链cDNA,并通过位点特异重组系统(BP重组)将双链cDNA转入pDONR22载体,构建初级文库。然后,将初级文库质粒通过同源重组转入pGADT7-DEST载体,构建次级文库。最后,将次级文库质粒转入酵母菌株Y187中构建成酵母双杂交文库。经鉴定,该酵母双杂交文库的滴度为7×107CFU/mL,平均插入cDNA片段长度大于1000bp,重组率大于95.8%。所构建的酵母双杂交文库质量较高,可用于后续的互作蛋白筛选工作。

利用病毒诱导的基因沉默cDNA文库高通量筛选鉴定棉花功能基因

为快速、高通量研究棉花功能基因,本研究以陆地棉欣试17为材料,棉花GhCLA1为标记基因,利用棉花病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)cDNA文库对幼苗生长和盐胁迫应答相关基因进行筛选和鉴定。VIGS转化7~14d观察植株长势和盐胁迫应答表型,共获得8个与幼苗生长相关以及4个与盐胁迫应答相关的基因。水培条件下,VIGS沉默GhANT17、GhSTP14、GhUSPA、GhFES1、GhS15-4、GhRBL8基因对植株地上部生长较对照植株有明显的抑制作用;VIGS沉默GhOIDO基因促进了植株生长;VIGS沉默GhRBCSC1基因抑制叶片中叶绿素的合成。盐胁迫处理条件下,与对照植株相比VIGS沉默GhATCYP1、GhSAC52基因提高了植株的耐盐性,VIGS沉默GhPSBW、GhRBCSC2的植株对盐胁迫更敏感。本研究建立了高通量筛选棉花功能基因的技术体系,为快速挖掘、研究棉花功能基因提供了可行技术手段。

棉花锌指蛋白GhZFP1相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

GhZFP1蛋白是从盐胁迫棉花幼苗cDNA文库中分离的一种CCCH型锌指蛋白.初步的生物学功能研究表明,过量表达该基因的转基因烟草耐盐性和抗病性显著提高.为深入研究GhZFP1蛋白的作用机制,构建pGBKT7-m1诱饵表达载体,利用酵母双杂交系统从盐胁迫诱导棉花cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白.通过阳性克隆的表型确定、PCR和限制性内切酶检测以及测序和生物信息学分析,获得9个与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白.双分子荧光互补实验证明,GhZFP1与GZIRD19A确实存在互作关系.通过分析这些靶蛋白的已知功能,为研究GhZFP1锌指蛋白的未知生物学功能提供重要信息.

Gateway技术构建盐和干旱胁迫下水稻根系混合cDNA文库及其质量鉴定

为研究水稻非生物胁迫响应信号转导的网络途径,揭示水稻抗逆的分子机制,以NaCl胁迫、干旱胁迫处理及正常生长的水稻根系为材料,采用Gateway技术构建了水稻根系受盐和干旱诱导的混合cDNA文库.cDNA文库质量分析表明,未经扩增的原始文库容量为1.5×106 cfu,插入片段大小主要为1 kb左右,重组率为100%.文库随机挑选克隆测序,结果显示插入序列完整性良好,文库中包含水解酶基因、逆境响应蛋白基因、氧化还原酶基因和富含甘氨酸的RNA结合蛋白质基因等.因此,本研究构建的盐和干旱诱导的水稻根系混合cDNA文库符合高质量文库的标准,可以用于进一步开展相关基因的克隆及功能研究.

苹果砧木珠眉海棠盐胁迫应答基因的微列阵研究

以盐胁迫下苹果的耐盐砧木珠眉海棠为材料,用SMARTTM方法构建了cDNA文库。随机挑取5 000个cDNA克隆制备芯片,得到差异表达的基因388个,其中249个表达上调、139个表达下调。分析其中变化量在8倍以上的42个基因,并对部分基因进行RT-PCR验证,结果与芯片杂交结果一致。根据功能把这些基因分为5类:光合作用相关基因、物质转运相关基因、基础代谢相关基因、逆境相关基因以及其他基因。其中直接参与盐应答的基因占34%,包括上游调控蛋白、合成植体内小分子渗透调节物的限速酶、胁迫产生的活性氧清除剂、直接调节离子运输和储存的蛋白等。用此cDNA微列阵体系,将基因芯片技术与cDNA文库相结合,成为全面研究盐胁迫下基因表达的有效途径。为进一步研究盐应答基因功能及盐胁迫机制提供参考。

酵母双杂交筛选与小黑杨PsnWRKY70相互作用的蛋白质

小黑杨PsnWRKY70是能够响应盐胁迫的转录因子。为了进一步探究该转录因子在参与盐胁迫应答途径中与哪些蛋白质之间存在相互作用关系,本研究以140 mmol/L Na Cl溶液处理过的小黑杨叶片为材料,利用热稳定核酸酶(DSN)构建了均一化的pGADT7-DEST酵母双杂交cDNA文库,将PsnWRKY70基因亚克隆至pGBKT7载体,形成BD-WRKY重组质粒,并以之为诱饵蛋白表达载体筛选小黑杨酵母双杂交cDNA文库。经过2轮酵母双杂交筛选以及回转验证试验,初步选出了5种与PsnWRKY70相互作用的蛋白质。对所筛选出的5种蛋白质进行保守结构域分析发现:有2种预测蛋白(HP1和HP2,其中HP1包含ClpP结构域),1种环化酶相关蛋白(CAP1),1种包含RNA识别基序的蛋白(RRM)以及1种泛素样修饰蛋白酶(Ulp1);对CAP1、HP1、RRM、HP2和Ulp1的毛果杨同源基因编码区上游2 000 bp范围内的顺式作用元件进行分析发现:CAP1、HP1、RRM、HP2和Ulp1的毛果杨同源基因上游启动子区均富含能够特异性结合WRKY转录因子的W-box。采用GST-pull down技术验证CAP1、HP1、RRM、HP2、Ulp1蛋白全长与PsnWRKY70转录因子之间是否存在直接的相互作用关系,将等量的His-X(X:CAP1、HP1、RRM、HP2或Ulp1)融合蛋白分别上样于正常谷胱甘肽琼脂糖树脂以及结合了GST或GST-WRKY蛋白的谷胱甘肽琼脂糖树脂中,SDS-PAGE电泳分离互作蛋白,最终Western blot结果显示:在体外状态下,HP1、RRM和Ulp1蛋白能够直接与PsnWRKY70相互作用,而CAP1和HP2则不能直接与PsnWRKY70相互作用。

Pedhn基因的克隆及表达分析

为深入研究胡杨的抗盐分子机制,并获得与之相关的抗逆基因,采用SMART技术构建了胡杨盐胁迫处理cDNA文库。经随机测序,得到一个编号为SSL061的EST序列,与欧美杨的脱水素基因有较高相似性,通过PCR快速扩增文库的方法获得了胡杨脱水素基因(Pedhn)。分析表明,该cDNA的长度为813 bp,拥有681 bp的开放读码框,共编码227个氨基酸。该序列包括两个重复的富含赖氨酸的K片段和由7个连续的丝氨酸残基组成的S片段,但是缺乏Y片段。RT-PCR结果表明,胡杨在未受胁迫的情况下脱水素基因的转录水平较低,而随着盐胁迫浓度的升高,脱水素基因的转录水平总体呈上升趋势。