RNA病毒质控物研究进展

RNA质控物是病毒分子生物学检测的关键因素,病毒颗粒和裸露的RNA片段由于有生物传染性,易降解而适合用作RNA质控物。近年来发展起来的内含靶RNA序列的盔甲RNA生物安全性高、不易降解、能全程参与病毒核酸的提取和反应,是理想的RNA病毒质控物。

基于MS2噬菌体病毒样颗粒的RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒质控品的制备

【目的】利用MS2噬菌体外壳蛋白可在体外自组装并包封外源核酸的特点,制备RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒质控品,并研究其稳定性和耐Rnase降解特性。【方法】选择猪流行性腹泻病毒保守性强的N蛋白基因为靶序列,插入到携带有MS2噬菌体外壳蛋白和PAC位点基因的下游,构建重组载体,经原核表达系统,表达重组蛋白,目的蛋白经过硫酸铵和凝胶过滤层析纯化,以及Benzonase核酸酶消化,利用电镜对嵌合蛋白进行物理表征,通过Taqman荧光RT-PCR验证盔甲RNA热稳定性及耐Rnase攻击能力。【结果】成功构建包含MS2噬菌体外壳蛋白、PAC位点和猪流行性腹泻病毒靶基因的重组载体。经过原核表达和纯化,得到均一的、直径为23~28 nm的MS2病毒样颗粒,该颗粒经核酸酶消化、RNA提取和荧光RT-PCR,证实其形成了包封靶基因的盔甲RNA。该盔甲RNA可以耐受Rnase的降解,并且无菌条件下可在37℃稳定存在15 d。【结论】MS2噬菌体外壳蛋白体外包封PEDV N蛋白靶序列制备的病毒样颗粒,可以作为RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒的质控品(盔甲RNA),其热稳定性好,耐Rnase攻击,可全程监控整个检测过程。

基于MS2噬菌体病毒样颗粒的RT-PCR检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)质控品制备

目的:制备热稳定性好、耐RNase攻击及可全程监控操作的核酸检测新型冠状病毒阳性质控品。方法:分别扩增MS2噬菌体外壳蛋白CP(含PAC位点)基因以及成熟酶蛋白A基因序列(含核糖体结合位点),先后插入质粒pET28a多克隆位点不同位置,构建通用重组载体pET28a/CP-A。合成包含ORF1ab基因、N基因和E基因三个靶标的特定核酸序列,插入到重组载体pET28a/CP-A中PAC位点的下游,构建包含靶序列的重组载体pET28a/CP-A/S。通过原核表达系统表达目的蛋白,采用硫酸铵和凝胶过滤层析进行纯化,利用透射电镜和动态光散射对蛋白质进行物理表征。全能核酸酶消化形成的盔甲RNA,通过RT-PCR检测其残余核酸和热稳定性。结果:成功构建包含MS2噬菌体外壳蛋白CP基因、成熟酶蛋白A基因和外源靶核酸的重组载体,目的蛋白在25℃、IPTG 0.3mmol/L、诱导14h时以可溶性形式得到高效表达,纯化后,得到了大小均一、直径为23~28nm的病毒样颗粒,经核酸酶消化后RT-PCR检测,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的盔甲RNA。加速破坏试验表明该盔甲RNA无菌过滤后可在37℃稳定保持10天。结论:在体外,利用MS2噬菌体外壳蛋白和成熟酶蛋白自组装包封外源靶序列制备的盔甲RNA,其热稳定性好,可全程监控整个检测过程,可作为核酸检测SARS-CoV-2的定性或定量质控品。