黑曲霉脂肪酶盖子结构域突变对其活性的影响

比较黑曲霉脂肪酶与黑曲霉酯酶的3-D结构发现二者在盖子结构域存在显著差异。根据已解析的酯酶的3-D结构信息,运用重叠延伸PCR技术,对黑曲霉脂肪酶的4个位点进行突变,以期获得开盖型黑曲霉脂肪酶。4个突变位点分别为形成黑曲霉脂肪酶盖子结构的α-螺旋与酯酶对应区域的α-螺旋相互置换;Ser84突变为Gly;Asp99突变为Pro;Lys108突变为Glu。4个重组质粒导入毕赤酵母GS115菌株进行异源表达后,仅pPCI9K-anl-D99P和pPCI9K-anl-K108E实现了活性表达。

不依赖油水界面激活的黑曲霉脂肪酶突变体的构建

为获得不依赖油水界面激活的黑曲霉脂肪酶(ANL)突变体,在生物信息学分析基础上,对黑曲霉脂肪酶盖子结构域两侧铰链区的氨基酸残基进行了置换突变,获得两个黑曲霉脂肪酶突变体(ANL-Ser84Gly和ANL-Asp99Pro)。对不同浓度对硝基苯丁酸酯的水解活性检测结果表明:ANL-Ser84Gly的催化活性仍依赖油水界面,而ANL-Asp99Pro的催化活性不再依赖油水界面。底物特异性检测结果表明:较ANL而言,ANL-Ser84Gly的比活力显著降低,其水解对硝基苯棕榈酸酯、对硝基苯豆蔻酸酯、对硝基苯月桂酸酯和对硝基苯癸酸酯的比活力分别降低了29.8%,53.1%,60.1%和77.1%;而ANL-Asp99Pro水解对硝基苯棕榈酸酯的比活力提高了2.2倍。铰链区的突变破坏了突变体蛋白质分子ANL-S84G与ANL-D99P的二级结构作用力,使突变体分子的二级结构域更趋不稳定,从而导致了突变体分子的热稳定性显著降低。不依赖油水界面激活的脂肪酶突变体的构建,将有利于深入了解脂肪酶界面激活的分子机制。