荧光定量PCR方法分析皱纹盘鲍HSP70在温度胁迫下的表达

根据皱纹盘鲍(Haliotis discus hannaiIno)HSP70和Actin mRNA序列,设计合成引物,建立了皱纹盘鲍HSP70的荧光定量PCR技术平台,并用于检测皱纹盘鲍在热激处理后不同恢复时间HSP70的转录水平变化。结果表明在热诱导后,肌肉组织HSP70的表达呈时间依赖性,存在先升高后降低的趋势,在热诱导后2h,肌肉HSP70基因的表达量明显升高,是对照组(0h)的15倍,随后HSP70的表达量继续升高,在诱导后12h达到最高值,是对照组的21倍。然后表达量开始回落,至热诱导后96h,HSP70表达量降至初始值,表现出一种瞬时表达的趋势。

用微卫星标记分析皱纹盘鲍群体的遗传变异

利用微卫星标记技术,对皱纹盘鲍山东长岛和辽宁獐子岛的两个野生群体以及山东崆峒岛一个养殖群体的遗传变异进行了分析。对6个微卫星基因座的多态性进行了评估,各基因座的多态信息含量(PIC)值均大于0.5,适合对鲍群体遗传结构的分析。结果表明,这6个基因座在3个皱纹盘鲍群体中共获得57个等位基因,等位基因数(A)平均为9.50,有效等位基因数(Ne)平均为5.8572,平均杂合度观测值(Ho)和期望值(He)分别为0.6925和0.7966;两个野生群体的杂合度观测值(Ho)和期望值(He)均高于养殖群体。上述结果为保护和利用皱纹盘鲍的遗传多样性提供了依据。

杂色鲍与盘鲍杂交F_1的早期生物学表现

比较研究杂色鲍(Haliotis diversicolor)(S)与盘鲍(H.discus discus)(J)正反交F1及其亲本自繁后代的卵裂速度和孵化速度,以及杂色鲍与盘鲍杂交F1及杂色鲍自繁幼体的成活率。在22～23℃下,杂色鲍自繁后代的早期发育速度快于盘鲍自繁后代。杂色鲍和盘鲍2细胞期分别为授精后45.3 min±8.9 min和59.3 min±8.9 min,卵裂间隔时间分别为21.7 min±2.9 min和27.0 min±2.6 min,孵化时间分别为授精后563.4 min和711.8 min。SJ和JS杂交F1的第一次卵裂速度均比他们的双亲慢,2细胞期分别为69.3 min±17.5 min和71.7 min±5.8 min;而卵裂间隔时间(τ0)表现出较强的母本效应,略长于母本,分别为22.2 min±4.7 min和31.3 min±6.1 min;孵化速度均慢于其母本自繁后代,分别为授精后632.7 min和授精后874.3 min。计算结果表明,自繁和杂交胚胎过程发育经历细胞周期数相当,SS、SJ、JJ和JS的从2细胞到孵化经历时间分别相当于23.9τ0、25.4τ0、24.1τ0和24.8τ0。另一方面,SJ杂交F1在附着变态阶段大量畸形、死亡,变态后成活率仅为母本自繁组合的1.2%,显现出较高程度的杂交不亲和。本文的研究结果为杂色鲍与盘鲍杂交F1的后续应用开发提供了依据,也为进一步研究杂交F1的遗传本质及父母本的基因互作关系奠定基础。

饲料中维生素B_6对皱纹盘鲍幼鲍蛋白质代谢的影响

以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannaiIno)幼鲍为研究对象,探讨维生素B6对其蛋白质代谢的影响。设计了3种维生素B6不同含量(0,40,4 000 mg/kg)的半精制饲料,在循环水养殖系统中养殖幼鲍240 d。结果表明,皱纹盘鲍内脏团和肌肉中磷酸吡哆醛(PLP)的含量随饲料中维生素B6的添加而显著升高(P<0.05)。饲料中不同维生素B6水平对肌肉组织中蛋白含量没有显著影响(P>0.05),而显著升高内脏团中蛋白质的含量(P<0.05)。内脏团和肌肉中的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活力随着饲料中维生素B6添加量的升高而显著增强,分别在维生素B6的添加量为4 000 mg/kg时取得最大值(P<0.05)。内脏团中所检测的各种氨基酸的含量与饲料中维生素B6添加量没有显著影响(P>0.05)。然而,肌肉中的天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、牛磺酸(Tau)的含量随着饲料中维生素B6添加量的升高而显著增加,并且分别在维生素B6添加量为4 000 mg/kg时取得最大值(P<0.05)。肌肉中甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)的含量在两个维生素B6添加组(40 mg/kg和4 000 mg/kg)之间没有显著差异(P>0.05),但均显著高于维生素B6缺乏组(0 mg/kg)的值(P<0.05)。

皱纹盘鲍野生与养殖群体遗传多样性的研究

用随机扩增多态DNA(RAPD)技术,对山东长岛(CW)、辽宁大连(DW)两个野生群体和山东崆峒岛(KC)一个养殖群体的皱纹盘鲍遗传多样性进行了分析。结果表明,CW和DW群体间的遗传距离为0.1703,CW和KC群体间的遗传距离为0.3673,DW和KC群体间的遗传距离为0.3477,显示野生群体与养殖群体之间的亲缘关系已发生了变化。CW,DW和KC三个群体的多态位点比例分别为49.22%、50.78%和43.75%;平均杂合度分别为0.3506,0.3408和0.3079。与野生群体相比,养殖群体的多态位点比例和杂合度都有不同程度的降低。

皱纹盘鲍基因型与环境互作的初步研究

以11个皱纹盘鲍(Haliotis discus hannaiIno)家系为材料分别在12,16和20℃养殖40 d,方差分析的结果表明温度和家系的相互作用对壳长增长率存在显著影响(P<0.05)。采用线性回归模式对皱纹盘鲍基因型与环境温度互作数据进行分析,得出了不同基因型的壳长增长率对环境温度的响应模式和对环境温度的灵敏度程度上所表现的序关系。

皱纹盘鲍遗传多样性的RAPD分析

对采自山东长岛和辽宁大连海域的两个自然群体皱纹盘鲍的遗传多样性进行了RAPD分析。16个随机引物在两群体中共检测到了179个位点,其中,长岛和大连群体中的多态位点数分别为88和91个,两群体的多态位点百分率分别为49·16%和50·84%;Shannon′s多样性指数(H0)分别为0·2496和0·2668。有70%以上的遗传变异来自群体内,显示两群体内均有较高程度的遗传变异。研究结果表明,长岛和大连的皱纹盘鲍群体已出现了明显的遗传分化。

高温胁迫下皱纹盘鲍不同养殖群体心率变化比较

高温是海水贝类度夏死亡的环境诱因之一。本研究应用一种非损伤性的心率检测方法,检测两个皱纹盘鲍养殖群体在高温胁迫条件下心率等生理指标的变化,尝试以心率变化指标比较这两个群体高温耐受能力。由于高温胁迫下皱纹盘鲍的心率随温度变化的关系符合阿伦尼乌斯(Arrhenius)公式,且心率随温度上升呈先上升后下降趋势,该研究通过计算两者直线拟合拐点即阿伦尼乌斯拐点温度(ABT,Arrhenius break temperatures)指标,用以指示皱纹盘鲍温度耐受程度。以此法对皱纹盘鲍两个群体(高温耐性,对照)各17个个体进行了测定分析,结果表明:两个群体间的ABT存在显著差异,高温耐性组的皱纹盘鲍的ABT显著高于对照组(P<0.05);个体ABT指标的高低与测定个体的壳高呈正相关(P<0.05)。本研究首次将探讨了高温胁迫下皱纹盘鲍心率变化规律,并以ABT为指标分析比较了两个皱纹盘鲍养殖群体间高温耐受能力,结果对研究皱纹盘鲍和其它贝类温度胁迫下生理响应及抗逆选育具一定借鉴意义。

皱纹盘鲍表型性状与肌肉重的相关与通径分析

选取日本岩手县×中国大连獐子岛的一个杂交家系,随机测定132尾三年龄皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)的壳长(x1)、壳宽(x2)、总重(x3)、壳重(x4)、软体部重(x5)及肌肉重(y)6个指标,计算各性状间的相关系数,采用通径分析方法计算以表型性状为自变量,肌肉重为依变量的通径系数、决定系数,对各性状的影响大小进行剖分,明确影响皱纹盘鲍肌肉重的主要表型性状,为皱纹盘鲍选育提供理论依据和理想的测度指标。结果表明:所测各表型性状与肌肉重之间的相关系数均达到极显著水平(P<0.01);软体部重对肌肉重的直接影响最大(为0.512),其次为总重,对肌肉重的直接影响为0.484,二者差异不显著(P>0.05),其他性状对肌肉重的直接影响均不大。剔除通径系数检验不显著的自变量,利用逐步回归的方法,建立以肌肉重为依变量的最优多元线性回归方程为:y=-0.381+0.239x3+0.342x5,其调整决定系数为0.989,表明所选性状是影响肌肉重的主要性状。

皱纹盘鲍杂交F_1AFLP标记偏分离现象初析

运用AFLP标记技术对皱纹盘鲍(Haliotis discus hannaiIno)及杂交F1代共86个个体进行分析,检测了32对AFLP引物组合,共产生2688个AFLP片段,平均每个引物组合产生84个片段。在子代中分离的片段有483个,包括母本标记230个,父本标记135个,双亲本共有的标记118个。卡方检验表明167个母本和100个父本标记符合1∶1的孟德尔分离比例,78个标记符合3∶1的分离比例,其偏分离比例分别达到27.4%,25.9%和33.9%。本研究发现无论是雌性还是雄性偏分离标记都主要是纯合子过剩,初步推测造成偏分离的原因可能与两个鲍鱼群体的某些基因不兼容有关。

福建沿海米氏凯伦藻赤潮对皱纹盘鲍鳃组织抗氧化酶活性的影响研究

本文初步研究了在较低赤潮密度(低于107个/m L)下,一株米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)对皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)鳃内几种抗氧化酶,如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的毒性效应,以期分析米氏凯伦藻对鲍鱼生命活动可能的胁迫方式。研究表明,米氏凯伦藻对SOD、CAT酶活性均造成不利影响,并未对GSH-Px酶造成不利影响,其酶活性显著高于对照组。米氏凯伦藻对SOD酶活性的影响表现为"先诱导后抑制"效应,24 h内,各处理组(0.1个/m L,0.5个/m L,1.0×104个/m L)中,酶活性急剧增高,分别是对照组的1.2,1.3,1.3倍,之后酶活性迅速下降,分别是对照组的77%,77%,73%。SOD能够清除机体体内多余的自由基,其活力变化反映了机体抵制自由基损伤能力已受到明显抑制。此外,米氏凯伦藻处理组中,CAT酶活性则处于"被抑制"状态,48 h内酶活性持续下降,分别降低至对照组的58%,51%,37%。CAT可以清除SOD歧化超氧阴离子自由基产生的H2O2,其活力的下降也可能造成机体内过氧化物的累积及氧化损伤。结果表明,即使未达到较高赤潮密度(不超过107个/m L)时,米氏凯伦藻短时间内仍可对鲍鱼鳃内关键抗氧化酶活性造成显著抑制效应,这极有可能导致鲍鱼机体抗氧化系统遭受严重损伤。

皱纹盘鲍排氨率变化特征及代谢产物对水质的影响研究

为研究不同规格皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)的排氨率变化特征和代谢产物对养殖水质的影响,于鲍摄食后的3、6、9、12、18、24 h时取水样对主要水质因子的变化情况进行测定,并根据总氨氮(TAN)浓度计算各规格组鲍的排氨率。实验结果表明,随着鲍体质量的增加,TAN浓度也随之增加(P<0.05),大规格组和小规格组中TAN浓度均在9 h时出现第一个波峰。大、中、小规格组鲍的单位体质量排氨率最大值依次为16.79、29.96、48.56μg/(g·h)。且小规格组鲍的排氨率显著高于大、中等规格组(P<0.05),各规格组中的NO_2~–-N和PO_4^(3–_-P浓度均在24 h时达到最大值,且除0 h外,大规格组中的NO_2^–-N和PO43–-P浓度均显著高于中、小规格组(P<0.05)。9 h时,大规格组中的NO_3~–-N浓度达到最大值,而中等规格组则在24 h时达到最大值。18 h时,中等规格和小规格组COD均达到最大值,而大规格组则是在24 h时浓度达到最大。因此,基于皱纹盘鲍的排氨率变化特征和TAN等在水体中的累积情况,可以预测水质变化规律并根据实际情况及时采取换水等相关操作,对促进养殖生物健康生长、降低病害发生风险、提高养殖效益等均有借鉴意义。

利用贝壳颜色标记分析皱纹盘鲍苗种繁育中的无意识选择

利用皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)贝壳颜色与摄食饵料相关且贝壳生成后色调不再改变等特点,以幼鲍贝壳顶部摄食底栖硅藻期间形成的褐红色部位的壳长指示它剥离时的壳长,将贝壳颜色用作形态标记,首次在皱纹盘鲍苗种繁育中观察到无意识选择。在投喂人工配合饵料后的第3天与第30天,分别从遗传背景不同的8组样本中取样测量每个幼鲍的褐红色部位壳长,分析每组幼鲍摄食配合饵料后不同时间所测褐红色部位壳长的平均值差异及相关统计学参数。结果表明,其中的7组在第30天时所测剥离时壳长平均值显著或极显著大于同组幼鲍在第3天时的数值;同时,6组样本在30 d时的剥离壳长方差、极差小于3 d时同组样本的数值,所有组合30 d剥离时壳长变异系数等于或小于3 d时同组样本的数值。上述结果提示,在投喂人工配合饵料后的第3天至第30天期间,剥离规格小的幼鲍淘汰率高于剥离规格大者,表明现行皱纹盘鲍育苗工艺对幼鲍在剥离前食用硅藻期间的生长速度进行了一次较高强度的选择,这是苗种管理中无意识选择行为导致的结果。

皱纹盘鲍三元杂交苗种制备与养成

以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)中国群体与日本群体的杂交(WJ)子1代为母本,在汕头养殖并选育了3代的"S"群体为父本,建立三元杂交组合(WJ-S)并尝试了海区围堰全生态模式养殖。以同期繁育的皱纹盘鲍中国群体与日本群体的杂交子1代(WJ-F1)为对照,比较WJ-S与对照组在生长速度和存活率等方面的差异。结果表明,在苗种和养成阶段,WJ-S的度夏存活率均显著高于同期对照;从围口壳幼体到养成阶段,WJ-S组的平均壳长大于同期对照,养成阶段WJ-S组的全湿重显著高于对照,表明皱纹盘鲍三元杂交子代的生长速度显著高于对照;从苗种到养成阶段的3次分选数据表明,WJ-S的大规格子代比例均高于对照,小规格苗种比率则低于对照,表明三元杂交鲍苗种的生长速度优于对照;在青岛崂山海区全生态养殖18个月,三元杂交组已达商品规格。上述结果表明,在二元杂交的基础上加入第三方亲本S制备的三元杂交皱纹盘鲍,在生长速度、夏季高水温期的存活率等方面都较皱纹盘鲍"中-日"杂交子代显著提高。

皱纹盘鲍肠道菌群组成及PCR-DGGE指纹图谱分析

对养殖和野生皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)不同个体间肠道菌群数量和种类组成进行了研究,并采用PCR-DGGE指纹技术对比分析了二者肠道优势菌群的差异。研究结果表明,养殖和野生皱纹盘鲍肠道好氧及兼性厌氧菌总数分别为(3.50±0.85)×106个/g,(3.03±1.10)×106个/g;两组鲍鱼肠道优势菌基本相同,均为弧菌属(Vibrio),次优势菌均为玫瑰杆菌属(Roseobacter)和希瓦氏菌属(Shewanella),在养殖组中检测到芽孢杆菌属(Bacillus),表明皱纹盘鲍对肠道细菌具有特异选择性。此外,PCR-DGGE指纹图谱结果表明,从养殖和野生皱纹盘鲍肠道样品分别获得14条和12条扩增条带,其中人工组中有2条特异性条带;二者相似性系数(戴斯系数)为92.31%。

水温和盐度对皱纹盘鲍“97”选群第6代变态及变态幼体生长存活的影响

采用室内受控方法研究了水温（14、16、18、20、22、24、26和28℃）和盐度（22、24、26、28、30、32、34、36、38和40）对皱纹盘鲍变态及变态幼体生长存活的影响。结果表明,水温对变态率、变态幼体存活率和生长率的影响极显著（P〈0.01）。14～28℃条件下,随着水温的升高,幼体变态率、变态幼体存活率和生长率均呈现先升高后降低的趋势。24℃时变态率最高,为86.05%;18℃时,变态幼体存活率最高,为96.00%;26℃时,投苗6 d内的壳长、壳宽生长率最大,分别为48.49μm/d和43.81μm/d;投苗15 d内的壳长、壳宽生长率最大,分别为68.06μm/d和59.69μm/d。盐度对皱纹盘鲍变态率及变态幼体生长率的影响极显著（P〈0.01）,对幼体存活率却无显著影响（P〉0.05）。22～40盐度条件下,幼体变态率先升高后降低,于32达最大值,为79.23%;变态的盐度下限为22,该盐度下仅有2.21%的个体能够完成变态。26～40条件下,变态幼体存活率均高达85%以上;随着盐度的升高,变态幼体生长率先升高后降低。投苗6 d内壳长、壳宽生长率均于34达最大值,分别为32.03μm/d和25.20μm/d;投苗15 d内壳长、壳宽生长率分别于34和32达最大值,为43.03μm/d和39.00μm/d。

粤东养殖区分离的2株海洋弧菌及其胞外产物对皱纹盘鲍致死毒性的初步分析

2011年秋,福建和广东地区养殖的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)相继暴发死亡。同年12月,我们从广东汕头病区取样分离得到2株弧菌,其中bb3为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),bb4为哈氏弧菌(V.harveyi)。本研究以bb3、bb4作为供试菌株对1龄皱纹盘鲍进行侵染实验,获得如下结果:20℃条件下,供试菌及其胞外产物粗提液注射处理均可致受试鲍死亡,浓度2.5×107cfu/mL的bb3与2.0×107cfu/mL的bb4悬液注射可分别引发43.33%和78.02%的受试鲍死亡;供试菌株的致死毒性与注射弧菌的总量正相关,与受试幼鲍的壳长、全湿重负相关;注射或浸泡-创伤两种处理方式均可导致受试鲍死亡,并且因注射供试弧菌而死亡的幼鲍软体部组织被健康鲍取食后也可引发取食者死亡;从侵染实验死亡的受试鲍软体部组织中可重新分离得到这2种供试弧菌。上述结果表明,溶藻弧菌bb3和哈氏弧菌bb4是皱纹盘鲍的病原菌。药敏试验表明,bb3、bb4均已对抗生素具有一定程度的耐药性,在测试的20种抗生素中,仅有头孢曲松和丁胺卡那霉素是这2株弧菌同时高度敏感的抗生素,但bb3和bb4却对8种抗生素同时表现出抗性。

皱纹盘鲍群体选育第四代成鲍4种多糖裂解酶基因表达的初步研究

根据已发表c DNA序列设计引物扩增了2龄皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)的褐藻酸酶、海带淀粉酶、α-淀粉酶和纤维素酶基因片段并测定其序列,同时用半定量反转录PCR和实时荧光定量PCR技术分析了它们在不同组织中的表达。结果表明:以cDNA为模板的PCR产物序列与已发表的相应基因序列一致;以DNA为模板扩增的a-淀粉酶和纤维素酶基因片段分别含438 bp和667 bp的内含子;在纤维素酶基因片段的外显子和内含子区各检测到2个SNP;4种多糖裂解酶基因均主要在消化腺中表达,褐藻酸酶基因的表达最强,其次为纤维素酶,表明在摄食海带的条件下,褐藻酸是成体皱纹盘鲍可利用的最重要多糖类物质之一。本文的结果为进一步开展皱纹盘鲍"97"选育群体在不同发育期、摄食不同藻类及不同培育环境下的多糖水解酶基因表达研究奠定了基础。

不同配合饲料对工厂化养殖皱纹盘鲍幼鲍鲍壳生长的影响

通过开展30天的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)幼鲍工厂化养殖实验,进一步分析山东省威海金牌生物科技股份有限公司研发的3种鲍配合饲料A、B、C的养殖效果。结果表明:鲍配合饲料A、B、C在水中均具有较好的稳定性,在很大程度上能够满足工厂化养殖对饵料稳定性要求;饲料A、饲料B与对照组饲料C相比,能够明显的促进幼鲍鲍壳生长,平均壳长日增长分别为145.28μm、138.14μm、130.72μm。

长岛皱纹盘鲍产业现状与发展对策研究

溯源长岛鲍鱼增养殖历史,分析产业现状,从种质、栖息地生境、产业化和品牌化建设四个方面查摆制约因素,并针对性提出政产学研金协同推动皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)种质保护和持续发展,建立长岛皱纹盘鲍标准体系,推进长岛皱纹盘鲍种业发展,推动皱纹盘鲍资源快速恢复,推进皱纹盘鲍生态养殖产业发展,加快品牌建设和宣传推介,加强资金保障的对策建议。