棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立

以棉花幼嫩子叶为材料,分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素,以棉花叶肉原生质体为受体,建立了稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括,选择自然生长12 d的棉花幼嫩子叶为材料,混合1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L–1甘露醇、20 mmol L–1 KCl、20 mmol L–1 MES、0.1 mol L–1 CaCl2和1.0 g L–1 BSA,在28℃黑暗条件下振荡酶解8 h,可游离出浓度达1.0×106 mL–1以上的纯净棉花叶肉原生质体。利用该方法将棉花锌指蛋白基因GhZFP2整合到pJIT166-GFP质粒载体,构建了GhZFP2:GFP融合载体,采用40%PEG-4000介导转化,获得高转化率的棉花叶肉原生质体。对目标基因瞬时表达产物检测表明,GhZFP2蛋白清晰定位在细胞核上。

转基因小麦目标基因通过花粉漂流的可能性研究

以去雄小麦为受体 ,在 10m范围内小麦花粉可在任何方向发生有效漂移 (使受体结实 ) ,花粉的最远有效漂移距离可达 80m。以不去雄的小麦、柱穗山羊草和卵穗山羊草为受体时 ,在距花粉源 1m的范围内 ,小麦间的异交率最高为 0 2 4 %、小麦与柱穗山羊草和卵穗山羊草间的异交率分别为 0 2 5 %和 0 ,花粉的最远有效漂移距离可达 2 0m。依照欧盟的标准 ,非转基因小麦即使与转基因品种相邻种植 ,其产品中的转基因成分也不会超标。在麦类近缘野生植物的起源中心及主要分布区 ,释放转基因小麦要特别慎重。

丝状真菌目标基因替换过程中的策略与方法

目标基因替换是基因功能分析的重要手段。随着基因组测序和转化技术的进展,该技术在丝状真菌功能基因组学中的应用越来越广泛,新的体系与方法不断建立和完善。文章在转化体系、打靶载体构建、突变体筛选等方面综述了丝状真菌目标基因替换过程中的策略与方法,并对各方法的优缺点及发展趋势进行了评述。

利用目标基因测序技术发现马方综合征FBN1新突变

目的：建立目标基因捕获结合第二代测序技术,对马方综合征（Marfan syndrome,MFS）患者的原纤维蛋白-1（fibrillin-1,FBN1）基因进行突变筛查,探讨MFS与FBN1基因突变的关系.方法：提取5例MFS患者外周血全基因组DNA,利用GenCap目标基因捕获技术（北京迈基诺公司）,设计FBN1的65个外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用illumina hiseq2000第二代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,用Sanger测序法对突变位点进行验证.结果：设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段.5例患者目标区域平均测序深度为173.85 ～ 280.73,97.10％ ～ 98.00％目标区域＞4×覆盖度.经过数据分析及Sanger测序验证,发现1个新的无义突变c.5968 C＞T（p.Gln1990X）.结论：本研究所建立的GenCap目标基因捕获技术结合illumina hiseq2000第二代测序技术成功的发现了FBN1的新突变.该方法快速而有效,可以使我们对MFS分子病因学有更好的认识.

衰老后PPARγ目标基因表达的改变与胰岛素抵抗的关系

目的 观察衰老降低 PPARγ表达的同时是否影响目标基因的表达 ,进而分析这些改变在胰岛素抵抗形成中的意义。方法 用Bergman创立的微小模型技术评价青年鼠 (1 0～ 1 2周龄 )和老年鼠 (2 4月龄 )的胰岛素敏感性 ,采用半定量 RT- PCR法检测大网膜脂肪组织 PPARγ目标基因脂细胞特异性脂肪酸结合蛋白 - 2 (adipocyte specific fatty acid binding protein2 ,a P2 )、脂蛋白脂酶 (lipoprotein lipase,LPL)、葡萄糖转运子 -4 (glucose transporter- 4 ,GLUT- 4 )及激素敏感脂酶 (hormone- sensitive lipase,HSL) m RNA的表达水平。结果 与青年鼠组比较 ,老年鼠组存在明显的胰岛素抵抗 (IR)。 IRI:1 1 .49± 6.92对 5.2 8± 1 .94(P<0 .0 5) ;SI1 2 :- 0 .0 5± 0 .0 2 7对 - 0 .0 2± 0 .0 1 8(P<0 .0 5) ;老年鼠组的 PPARγ目标基因a P2 m RNA(1 .2 5± 0 .0 6对 1 .50± 0 .2 0 ,P=0 .1 3)、LPL m RNA (0 .97± 0 .1 0对 1 .42± 0 .2 1 ,P<0 .0 5)表达降低 ,但前者未达到统计学意义 ,而GLUT- 4 m RNA表达无降低趋势 ,老年鼠 HSL m RNA0 .39± 0 .0 2对 0 .68± 0 .1 3(P<0 .0 5)表达也明显降低。结论 衰老后 PPARγ目标基因表达的改变在一定程度上代表了脂细胞功能随增龄而减退 。

目标基因捕获测序技术检测肺动脉高压致病基因突变的研究

目的:利用目标基因捕获测序技术,对9例肺动脉高压(PAH)患者进行4个已知致病基因突变筛查,探讨利用目标基因捕获测序技术对PAH进行基因诊断的可行性。方法:抽取PAH患者外周血,提取全基因组DNA,制备文库。设计骨形成蛋白2型受体(BMPR2)、激活素受体样激酶1(ACVR1)、细胞内皮糖蛋白(En G),信号蛋白SMAD4基因(SMAD4)外显子区域特异性捕获探计,利用目标基因捕获技术,进行杂交,富集目标基因组区域的DNA片段,利用Illumina Hi Seq 2000进行高通量测序,分析致病基因突变与PAH的相关性。结果:9例患者中,2例患者发现BMPR2基因突变,1例发现ACVRL1突变,BMPR2突变临床症状较重,ACVRL1突变发病年龄较小。结论:本研究利用目标基因捕获测序技术,在9例PAH患者中查出3个致病基因突变。该方法快速有效,可实现对PAH致病基因突变的初步筛查,对PAH的临床基因诊断具有重要价值。

利用目标基因捕获结合二代测序技术发现左心室心肌致密化不全MYBPC3基因错义突变

目的:建立目标基因捕获结合第二代测序技术,对孤立性左心室心肌致密化不全(IVNC)患者的已知致病基因MYBPC3进行突变筛查。方法:收集5例IVNC患者及一级亲属的超声影像学资料,并提取外周血全基因组DNA,设计MYBPC3外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,富集目标基因组区域DNA片段,利用二代测序技术,确定突变位点,并使用Sanger测序法在其一代亲属中验证。结果:目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA目标靶片段。在5例IVNC患者中,发现1例MYBPC3基因杂合非同义突变c.G1000A(p.E334K),该突变位于MYBPC3基因第13外显子中,测序深度249.65。经过数据分析与Sanger测序验证后,父亲发现此突变位点,母亲未发现提示突变的父亲的遗传。结论:本研究所建立的Gen Cap目标基因捕获测序技术结合二代测序技术成功发现了MYBPC3基因突变。

目标基因捕获结合第2代测序技术检测原发性高血压致病基因突变

目的建立目标基因捕获结合第2代测序技术,对原发性高血压（EH）患者的13个已知致病基因进行突变筛查,探讨EH与致病基因突变的关系。方法提取5例EH患者外周血全基因组DNA,利用GenCap目标基因捕获技术,设计内皮素转化酶1（ECE1）、G蛋白调节信号5（RGS5）、钠钾三磷腺苷酶通道β1多肽（ATP1β1）、选择素E（SELE）、血管紧张素原（AGT）、血管紧张素受体1（AGTR1）、α-内收蛋白（ADD1）、细胞色素P450 3A亚家族多肽5（CYP3A5）、一氧化氮合酶3（NOS3）、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β3（GNβ3）、一氧化氮合酶2A（NOS2A）、苯基乙醇胺N-甲基转移酶（PNMT）和前列腺素I2合成酶（PTGIS）基因外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用Illumina HiSeq 2000第2代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,对选定的突变位点用Sanger测序法验证。结果设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段。目标区域平均测序深度为301.12~431.92,99.30%~99.70%目标区域覆盖度。5例患者中ADD1基因发现3个错义突变;AGT基因发现1个错义突变;SELE基因发现2个错义突变;PNMT基因发现1个剪切位点突变;PTGIS基因发现1个错义突变。结论 GenCap目标基因捕获技术结合Illumina HiSeq 2000第2代测序技术成功发现了EH患者的致病基因突变。该方法快速有效,对深入研究EH的分子病因学有重要意义。

利用目标基因捕获结合第二代测序技术发现腹主动脉瘤致病基因突变

目的建立目标基因捕获结合第二代测序技术对腹主动脉瘤患者原纤维蛋白1(FBN1)基因进行突变筛查,探讨腹主动脉瘤与FBN1基因突变的关系。方法提取4例腹主动脉瘤患者外周血全基因组DNA,利用Gen Cap目标基因捕获技术,设计FBN1的65个外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用Illumina Hi Seq2000第二代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,用Sanger测序法对突变位点进行验证。结果设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段。4例患者目标区域平均测序深度为448.15~536.61,99.5%~99.7%目标区域覆盖度。经过数据分析及Sanger测序验证发现1个新的错义突变c.2753 C>G(p.Pro918Arg),db SNP137数据库、千人基因组及内部800名正常汉族人数据库均无此突变。经SIFT预测为有害突变。结论本研究所建立的Gen Cap目标基因捕获技术结合Illumina Hi Seq2000第二代测序技术成功地发现了FBN1的新突变。该方法快速而有效,对腹主动脉瘤分子病因学有更好的认识。

CT纹理技术及目标基因检测鉴别甲状腺结节良恶性的可行性分析

目的探讨甲状腺良恶性结节实施CT纹理技术及目标基因鉴别检测的可行性。方法对本院20例甲状腺结节患者(2019年1月到2019年6月间)均实施CT纹理技术及目标基因表达分析,分析诊断结果。结果恶性结节中熵值与良性结节对比更高(P<0.05)。CT纹理分析及目标基因联合诊断对甲状腺结节诊断敏感性、特异性、准确性最高,分别为90.0%、94.4%、92.9%。结论甲状腺良恶性结节实施CT纹理技术及目标基因联合诊断效果更好。

递减杂交法分离和筛选目标基因

本文介绍新近发展起来的递减杂交技术,它是依据两种不同组织或相同组织但有某些基因表达的差异,选择性地分离和筛选组织中特异表达的mRNA。递减杂交有几种不同的技术途径,但都包含三个基本环节:(1)杂交DNA或RNA的选择;(2)杂交条件的选择和(3)杂交后DNA的分离和筛选。递减杂交可用于基因组中大片段DNA缺失的筛选,而目前主要用于筛选脑功能区域特异表达mRNA和mRNA缺陷研究。它的优点在于,利用mRNA表达差异,直接去筛选未知的目标基因,而且可以通过建立杂交后的cDNA文库,获得一组组织特异表达的候选基因,为进一步深入研究该组织的遗传组成提供有用的信息,它已被脑分子生物学家应用和发展,它的技术仍在不断的完善中。

应用目标基因捕获结合二代测序技术检测无遗传性眼病家族史的遗传性视网膜疾病患者的致病基因

背景遗传性视网膜疾病（HRDs）是以原发性视网膜病变为主要病理改变、视力和色觉等视敏度严重损害为主要临床表现的致盲眼病，其与遗传因素密切相关，是『晦床上难治性盲的首要原因。目的应用目标基因捕获结合二代测序技术检测HRDs的致病基因。方法选择2014年1月至2015年1月在宁夏眼科医院就诊的无遗传性眼病家族史的20例HRDs患者作为研究对象。收集所有患者及其家庭成员临床资料，完善眼科检查，抽取患者和家庭正常成员外周静脉血，提取DNA。针对232个HRDs已知致病基因的目标序列设计并定制目标序列捕获芯片，借助高通量二代测序技术检测患者的遗传变异，数据经分析滤过，候选突变进行Sanger测序验证和致病性评估，明确致病基因和突变，并对表型和基因型间的关系进行分析。结果20例HRDs患者中有11例患者检测到致病性突变位点，共涉及9个基因，阳性率为55％。其中有8例患者检测到复合杂合突变，3例患者为纯合子突变，均为新发现的突变位点。通过对家系成员的基因筛查分析，6例HRDs患者为常染色体隐性遗传，5例遗传类型不确定。结合临床表型以及基因检测结果分析，11例HRDs患者的诊断分别为锥杆细胞营养不良5例，致病基因分别为ABCA4、RPE65、USH2A、RIMSl和RHO；Leber先天性黑嚎3例，致病基因分别为CRBl（2例）和LCA5；先天性静止性夜盲1例，致病基因为PRP乃；Best卵黄样黄斑营养不良1例，致病基因为BESTl基因；Stargardt病1例，致病基因为ABCA4基因。结论目标基因捕获结合二代测序技术可以对视网膜疾病患者进行快速、有效的基因诊断，结合临床特征分析有助于提高隐性遗传及遗传方式不明的HRDs的临床诊断水平。

雌二醇、双酚A和苯并［a］芘对食蚊鱼目标基因表达的影响

比较雌二醇(E2)、双酚A(BPA)、苯并[a]芘(B[a]P)和他莫昔芬(TAM)暴露对食蚊鱼(Gambusia affinis)卵黄蛋白原基因(VTGα)、雌激素受体基因(ERα)和细胞色素P4501A基因(CYP4501A)表达的影响。结果显示,低浓度E2单独暴露诱导VTGα和ERα表达量显著上调,但高浓度E2极显著抑制VTGα、ERα和CYP4501A表达。高浓度B[a]P明显抑制VTGα表达;B[a]P对ERa表达无明显抑制作用,但致CYP4501A表达量显著上升。BPA显著上调VTGα和ERα的表达,但低浓度BPA致CYP4501A表达显著下降。B[a]P+高浓度E2联合暴露,致VTGα和ERα表达量显著提高,但B[a]P+低浓度E2联合暴露抑制ERα的表达。B[a]P+E2不同浓度组均致CYP4501A表达水平呈极显著上升;B[a]P+E2+TAM联合暴露均致VTGα、ERα和CYP4501A表达量显著或极显著增加。不同浓度组(B[a]P+BPA)均致VTGα、ERα和CYP4501A表达量显著上调;B[a]P+BPA+TAM暴露,VTGα表达量呈极显著下降,相反,均致ERα和CYP4501A的表达量显著增加。单一毒物实验与联合毒物实验的比较表明,ERα和AhR介导的生理过程机制十分复杂,通过这两个途径对外来污染物的调控跟化合物的效应浓度有关,不是单独暴露效应的简单相加或相减。另外还进行E2/BPA+B[a]P+TAM联合暴露实验,来研究TAM对ERα受体途径和AhR受体途径的影响,结果显示TAM对两个途径均有抑制作用。

TaNAC14转基因小麦外源目标基因拷贝数及遗传稳定性分析

外源基因拷贝数是影响转基因植物遗传稳定性及其自身表达水平的重要因素。为了探析TaNAC14基因在小麦生长发育中的生物学功能,本研究通过农杆菌介导的遗传转化法获得了14个T0代TaNAC14转基因小麦植株,采用BASTA溶液涂抹和目标序列PCR检测相结合的方法,从14个转基因小麦植株中鉴定出9个阳性植株。通过TaqMan实时定量PCR方法,以小麦内源单拷贝基因Pinb为内参基因,对9个T0代转基因小麦阳性植株中外源目标基因拷贝数进行检测,结果表明,T0代转基因小麦再生植株中有5株为单拷贝,4株为双拷贝,其中单拷贝插入整合的比率接近55.6%。选取单拷贝转基因植株收获的种子进行种植,根据BASTA溶液涂抹鉴定对T0:1代小麦株系遗传情况进行分析,结果表明目标基因TaNAC14是可遗传的。此外,还对T1代转基因小麦目标基因表达水平进行测定,结果表明,与野生型JW1相比,各转基因小麦植株目的基因TaNAC14表达量均极显著增加。该研究结果为后续TaNAC14基因的功能研究奠定了基础。

目标基因测序技术检测与下颌前突相关的BMP-Smad信号通路基因突变

目的:采用目标基因捕获联合二代测序技术探索BMP-Smad信号通路基因与下颌前突(mandibular prognathism)相关的变异。方法 :从同济大学附属口腔医院收集176例下颌前突患者及155例正常对照,分别采集5 m L静脉血并提取基因组DNA。采用Nimble Gen捕获富集系统对病例对照组的23个目标基因的编码区和侧翼区进行捕获富集,通过Illumina Hiseq 2000测序平台进行测序。通过比较变异位点基因型及等位基因分布频率的差异,探索与下颌前突相关的突变位点。结果:共发现7个与下颌前突相关的常见变异,分别位于5个基因上:chr4:81975103(BMP3)、rs7078571(BMPR1A)、chr2:148686946(ACVR2A)、rs1128919(ACVR2A)、rs2070489(ACVR2B)、chr18:48610378(SMAD4)、chr18:48610376(SMAD4)。未发现罕见变异的分布差异有显著性。结论 :通过目标基因测序的方法检测到了病例对照组中的常见变异和罕见变异,并发现了与下颌前突相关的可能致病基因BMP3、BMPR1A、ACVR2A、ACVR2B、Smad4。未检测到下颌前突的罕见致病位点。

日发现新材料可瞬间检测出目标基因

目前基因检测的常用方法是从血液中提取DNA，并对可能含目标基因的DNA片段进行复制，以找出目标基因。但DNA片段的复制需要几小时甚至几十个小时，并容易出现误差。

日本基因编辑食品研发最新动向和启示

基因编辑食品,是指应用对生物体内特定目标基因进行精准修饰的生物工程技术开发的食品。基因编辑食品与转基因食品不同,基因编辑食品只是通过基因编辑手段编辑物种本身的基因,不转入其他物种的基因,因此与传统育种方法生产的食品无异。早期的基因工程技术只能将遗传物质随机插入宿主基因组,自从2012年精准的 CRISPR /Cas9基因编辑技术问世以来,全球基因编辑食品行业发展进入快车道。近年来,日本基因编辑技术在农业品种改良、病虫害防治.

目标基因测序技术检测后纵韧带骨化致病基因突变

[目的]建立目标基因测序技术，对后纵韧带骨化（ossification of the posterior longitud inalligament，OPLL）患者的11个已知致病基因进行突变筛查，探讨OPLL与致病基因突变的关系。[方法]提取6例OPLL患者外周血全基因组DNA，利用GenCap目标基因捕获技术（北京迈基诺公司），设计骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic pro—tein2，BMP2）、骨形态发生蛋白-4（bone morphogenetic protein4，BMP4）、骨形态发生蛋白-9（bone morphogenetic protein 9，BMP9）、Ⅺ型胶原蛋白以（collagen type XI alpha 2，COLllA2）、Ⅵ型胶原蛋白理1（collagen type VIM pha1，COL6A1）、核苷酸焦磷酸酶（ectonucleotide pyrophosphatase／phosphodiesterase 1，ENPPl）、成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）、成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1，FGFRl）、成纤维细胞生长因子受体2（fibroblast growth factor receptor2，FGFR2）、转化生长因子一β3（transforming growth factor beta3，TGFB3）和转化生长因子一8受体2（transforming growth factor beta receptorII，TGFBR2）基因外显子区域特异性捕获探针，与基因组DNA文库进行杂交，将目标基因组区域的DNA片段进行富集后，再利用illumina hiseq2000第二代测序仪进行测序，通过数据分析，确定突变位点，对选定的突变位点用Sanger测序法进行验证。[结果]设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段。目标区域平均测序深度为426．85～976．15，99．30％-100％目标区域覆盖度。在1例患者中发现COL6A1基因的1个错义突变，此位点检测结果与Sanger测序结果完全一致。[结论]目标基因测序技术成功发现了OPLL患者的致病基因突变。该方法快速而有效，对深入研究OPLL的分子病因学有重要意义。

GUS为负标记的稻瘟病菌目标基因替换突变体双筛选体系(英文)

目标基因替换是基因功能研究的重要方法,在生物工程领域广泛应用。为了提高真菌目标基因替换的效率,以稻瘟病菌为研究对象,建立了一种以gusA基因为负筛选标记的目标基因替换突变体双筛选体系(GUS-DS)。首先,检测了78个真菌菌株的内源GUS活性,发现除3个菌株外均呈阴性。同时,将gusA基因导入稻瘟病菌、镰刀病菌、炭疽病菌后,转化子可获得高的GUS活性。表明gusA可用作真菌中的筛选标记。然后,以gusA为负标记,HPH为正标记,以过氧化物酶体定位信号受体基因MGPEX5与MGPEX7的替换为例,建立稻瘟病菌GUS-DS体系。对潮霉素抗性筛选获得的转化子通过GUS活性检测进一步筛选,呈阴性者为可能突变体。通过PCR与Southern杂交对可能突变体进行验证,以此评估GUS-DS的筛选效率。结果表明GUS-DS将Δmgpex5与Δmgpex7的筛选效率由原来的65.8%和31.2%分别提高到90.6%和82.8%。另外,还建立了一种适合于GUS-DS的多重PCR法(M-PCR)用于突变体的验证。通过扩增目标位点的不同区段,可以有效区分突变体、野生型和随机插入转化子。M-PCR法验证突变体简便、迅速,可信度与Southern杂交相同。GUS-DS及M-PCR为功能基因组学及生物工程的研究提供了有力的工具。