利用目标基因捕获结合二代测序技术发现左心室心肌致密化不全MYBPC3基因错义突变

目的:建立目标基因捕获结合第二代测序技术,对孤立性左心室心肌致密化不全(IVNC)患者的已知致病基因MYBPC3进行突变筛查。方法:收集5例IVNC患者及一级亲属的超声影像学资料,并提取外周血全基因组DNA,设计MYBPC3外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,富集目标基因组区域DNA片段,利用二代测序技术,确定突变位点,并使用Sanger测序法在其一代亲属中验证。结果:目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA目标靶片段。在5例IVNC患者中,发现1例MYBPC3基因杂合非同义突变c.G1000A(p.E334K),该突变位于MYBPC3基因第13外显子中,测序深度249.65。经过数据分析与Sanger测序验证后,父亲发现此突变位点,母亲未发现提示突变的父亲的遗传。结论:本研究所建立的Gen Cap目标基因捕获测序技术结合二代测序技术成功发现了MYBPC3基因突变。

目标基因捕获测序技术检测肺动脉高压致病基因突变的研究

目的:利用目标基因捕获测序技术,对9例肺动脉高压(PAH)患者进行4个已知致病基因突变筛查,探讨利用目标基因捕获测序技术对PAH进行基因诊断的可行性。方法:抽取PAH患者外周血,提取全基因组DNA,制备文库。设计骨形成蛋白2型受体(BMPR2)、激活素受体样激酶1(ACVR1)、细胞内皮糖蛋白(En G),信号蛋白SMAD4基因(SMAD4)外显子区域特异性捕获探计,利用目标基因捕获技术,进行杂交,富集目标基因组区域的DNA片段,利用Illumina Hi Seq 2000进行高通量测序,分析致病基因突变与PAH的相关性。结果:9例患者中,2例患者发现BMPR2基因突变,1例发现ACVRL1突变,BMPR2突变临床症状较重,ACVRL1突变发病年龄较小。结论:本研究利用目标基因捕获测序技术,在9例PAH患者中查出3个致病基因突变。该方法快速有效,可实现对PAH致病基因突变的初步筛查,对PAH的临床基因诊断具有重要价值。

目标基因捕获结合第2代测序技术检测原发性高血压致病基因突变

目的建立目标基因捕获结合第2代测序技术,对原发性高血压（EH）患者的13个已知致病基因进行突变筛查,探讨EH与致病基因突变的关系。方法提取5例EH患者外周血全基因组DNA,利用GenCap目标基因捕获技术,设计内皮素转化酶1（ECE1）、G蛋白调节信号5（RGS5）、钠钾三磷腺苷酶通道β1多肽（ATP1β1）、选择素E（SELE）、血管紧张素原（AGT）、血管紧张素受体1（AGTR1）、α-内收蛋白（ADD1）、细胞色素P450 3A亚家族多肽5（CYP3A5）、一氧化氮合酶3（NOS3）、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β3（GNβ3）、一氧化氮合酶2A（NOS2A）、苯基乙醇胺N-甲基转移酶（PNMT）和前列腺素I2合成酶（PTGIS）基因外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用Illumina HiSeq 2000第2代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,对选定的突变位点用Sanger测序法验证。结果设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段。目标区域平均测序深度为301.12~431.92,99.30%~99.70%目标区域覆盖度。5例患者中ADD1基因发现3个错义突变;AGT基因发现1个错义突变;SELE基因发现2个错义突变;PNMT基因发现1个剪切位点突变;PTGIS基因发现1个错义突变。结论 GenCap目标基因捕获技术结合Illumina HiSeq 2000第2代测序技术成功发现了EH患者的致病基因突变。该方法快速有效,对深入研究EH的分子病因学有重要意义。

利用目标基因捕获结合第二代测序技术发现腹主动脉瘤致病基因突变

目的建立目标基因捕获结合第二代测序技术对腹主动脉瘤患者原纤维蛋白1(FBN1)基因进行突变筛查,探讨腹主动脉瘤与FBN1基因突变的关系。方法提取4例腹主动脉瘤患者外周血全基因组DNA,利用Gen Cap目标基因捕获技术,设计FBN1的65个外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用Illumina Hi Seq2000第二代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,用Sanger测序法对突变位点进行验证。结果设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段。4例患者目标区域平均测序深度为448.15~536.61,99.5%~99.7%目标区域覆盖度。经过数据分析及Sanger测序验证发现1个新的错义突变c.2753 C>G(p.Pro918Arg),db SNP137数据库、千人基因组及内部800名正常汉族人数据库均无此突变。经SIFT预测为有害突变。结论本研究所建立的Gen Cap目标基因捕获技术结合Illumina Hi Seq2000第二代测序技术成功地发现了FBN1的新突变。该方法快速而有效,对腹主动脉瘤分子病因学有更好的认识。

应用目标基因捕获结合二代测序技术检测无遗传性眼病家族史的遗传性视网膜疾病患者的致病基因

背景遗传性视网膜疾病（HRDs）是以原发性视网膜病变为主要病理改变、视力和色觉等视敏度严重损害为主要临床表现的致盲眼病，其与遗传因素密切相关，是『晦床上难治性盲的首要原因。目的应用目标基因捕获结合二代测序技术检测HRDs的致病基因。方法选择2014年1月至2015年1月在宁夏眼科医院就诊的无遗传性眼病家族史的20例HRDs患者作为研究对象。收集所有患者及其家庭成员临床资料，完善眼科检查，抽取患者和家庭正常成员外周静脉血，提取DNA。针对232个HRDs已知致病基因的目标序列设计并定制目标序列捕获芯片，借助高通量二代测序技术检测患者的遗传变异，数据经分析滤过，候选突变进行Sanger测序验证和致病性评估，明确致病基因和突变，并对表型和基因型间的关系进行分析。结果20例HRDs患者中有11例患者检测到致病性突变位点，共涉及9个基因，阳性率为55％。其中有8例患者检测到复合杂合突变，3例患者为纯合子突变，均为新发现的突变位点。通过对家系成员的基因筛查分析，6例HRDs患者为常染色体隐性遗传，5例遗传类型不确定。结合临床表型以及基因检测结果分析，11例HRDs患者的诊断分别为锥杆细胞营养不良5例，致病基因分别为ABCA4、RPE65、USH2A、RIMSl和RHO；Leber先天性黑嚎3例，致病基因分别为CRBl（2例）和LCA5；先天性静止性夜盲1例，致病基因为PRP乃；Best卵黄样黄斑营养不良1例，致病基因为BESTl基因；Stargardt病1例，致病基因为ABCA4基因。结论目标基因捕获结合二代测序技术可以对视网膜疾病患者进行快速、有效的基因诊断，结合临床特征分析有助于提高隐性遗传及遗传方式不明的HRDs的临床诊断水平。

利用目标基因测序技术发现马方综合征FBN1新突变

目的：建立目标基因捕获结合第二代测序技术,对马方综合征（Marfan syndrome,MFS）患者的原纤维蛋白-1（fibrillin-1,FBN1）基因进行突变筛查,探讨MFS与FBN1基因突变的关系.方法：提取5例MFS患者外周血全基因组DNA,利用GenCap目标基因捕获技术（北京迈基诺公司）,设计FBN1的65个外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用illumina hiseq2000第二代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,用Sanger测序法对突变位点进行验证.结果：设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段.5例患者目标区域平均测序深度为173.85 ～ 280.73,97.10％ ～ 98.00％目标区域＞4×覆盖度.经过数据分析及Sanger测序验证,发现1个新的无义突变c.5968 C＞T（p.Gln1990X）.结论：本研究所建立的GenCap目标基因捕获技术结合illumina hiseq2000第二代测序技术成功的发现了FBN1的新突变.该方法快速而有效,可以使我们对MFS分子病因学有更好的认识.

目标基因测序技术检测与下颌前突相关的BMP-Smad信号通路基因突变

目的:采用目标基因捕获联合二代测序技术探索BMP-Smad信号通路基因与下颌前突(mandibular prognathism)相关的变异。方法 :从同济大学附属口腔医院收集176例下颌前突患者及155例正常对照,分别采集5 m L静脉血并提取基因组DNA。采用Nimble Gen捕获富集系统对病例对照组的23个目标基因的编码区和侧翼区进行捕获富集,通过Illumina Hiseq 2000测序平台进行测序。通过比较变异位点基因型及等位基因分布频率的差异,探索与下颌前突相关的突变位点。结果:共发现7个与下颌前突相关的常见变异,分别位于5个基因上:chr4:81975103(BMP3)、rs7078571(BMPR1A)、chr2:148686946(ACVR2A)、rs1128919(ACVR2A)、rs2070489(ACVR2B)、chr18:48610378(SMAD4)、chr18:48610376(SMAD4)。未发现罕见变异的分布差异有显著性。结论 :通过目标基因测序的方法检测到了病例对照组中的常见变异和罕见变异,并发现了与下颌前突相关的可能致病基因BMP3、BMPR1A、ACVR2A、ACVR2B、Smad4。未检测到下颌前突的罕见致病位点。

高通量测序技术筛查单基因隐性遗传病

目的探讨用高通量测序技术筛查新生儿单基因隐性遗传病,评估其用于孕前筛查或产前诊断的可行性。方法用目标基因筛选和高通量测序分析法分别对非孕妇的血液基因组DNA和孕妇的血浆游离DNA样本进行400多种遗传病相关基因的全面筛查分析。结果用高通量测序技术成功地在非孕妇的血液中检测出相关的致病基因,并在疑似地中海贫血患者的基因组中发现了导致地中海贫血症的致病突变基因HBB（chr11：5246595 C/G）;成功地从孕妇血浆游离DNA检测出来自胎儿的遗传病相关致病基因突变,平均每个样本中有1～4个突变,基因型为杂合型。结论高通量测序技术可用于隐性基因携带者的孕前筛查及产前诊断。

非综合征性遗传性耳聋的基因诊断进展

非综合征性耳聋是感官缺陷中最常见的一类疾病。耳聋基因诊断正在经历从一代测序到各种高通量测序平台的技术变革,针对不同人群有相应的检测手段。基因诊断对于早期发现、早期预防、耳毒性药物应用及生育风险评估有重要指导意义。

三个晶状体半脱位家系FBN1基因和ADAMTSL4基因突变研究

目的利用目标基因捕获高通量测序技术和Sanger测序方法,对三个先天性晶状体半脱位家系患者FBN1和ADAMTSL4基因进行突变筛查。方法提取三个家系14例晶状体半脱位患者及3名家系正常成员外周静脉血全基因组DNA,利用目标基因捕获技术,设计FBN1的65个外显子区域捕获探针,与基因组DNA文库混合杂交,收集洗脱处理后的目标基因组DNA,再利用Hi Seq2000进行高通量测序,通过数据分析,确定突变位点,用Sanger法验证测序结果;同时利用Sanger法对3名先证者ADAMTSL4基因进行测序分析。结果通过高通量测序和Sanger法验证,分别发现3个家系3个不同的FBN1基因编码区的杂合错义突变,通过Sanger测序法发现4个ADAMTSL4基因编码区的单核苷酸多态性改变。结论 3个先天性晶状体半脱位家系的致病性基因为FBN1基因,FBN1基因的突变是导致患者晶状体半脱位的临床表型的主要原因。

一例重度智力障碍患儿的LINS1基因变异分析

目的对1例不明原因智力障碍患儿进行遗传学分析,明确导致常染色体隐性智力障碍-27(mental retardation,non-syndromic,autosomal recessive,MRT27)的遗传学病因。方法应用单核苷酸多态-微阵列比较基因组杂交技术以及目标基因捕获测序法对患儿进行智力障碍/发育迟缓相关基因外显子检测。结果排除患儿基因组微缺失/微重复。目标基因捕获测序法检测到患儿的LINS1基因c.722delA(p.Asp241fs)纯合变异,父母均携带c.722delA(p.Asp241fs)杂合变异,符合常染色体隐性遗传方式。结论LINS1基因c.722delA(p.Asp241fs)变异导致了患儿MRT27的发生。

先天性晶状体半脱位一家系FBN1基因突变研究及手术治疗

目的对一个先天性晶状体半脱位家系进行FBN1基因突变筛查,总结该家系晶状体半脱位的治疗方法。设计回顾性病例系列。研究对象 2014年5月就诊于北京同仁医院白内障中心一个先天性晶状体半脱位家系人员25例。方法提取该家系成员外周血全基因组DNA,利用目标基因捕获技术,收集目标基因组DNA,再利用HiSeq2000进行高通量测序,确定突变位点,用Sanger法验证测序结果。晶状体半脱位90°~180°者4例(8眼)行一期囊袋张力环IOL植入术(Phaco+CTR+IOL),二期晶状体囊袋复合体(IOL-CTR)单点巩膜缝合固定术。晶状体半脱位大于180°者1例(2眼)行晶状体玻璃体切除IOL植入,巩膜缝合固定术(PPL+PPV+IOL)。2例(4眼)行晶状体囊内摘除术(ICCE),1例(1眼)行玻璃体切除术(PPV)。主要指标FBN1基因测序结果、术式、最佳矫正视力(BCVA)。结果该家系所有患者FBN1基因38号外显子mRNA第4588位碱基均出现C→T杂合性错义改变,导致患者均携带c.4588C>T(p.R1530C)突变体,而家系正常个体15人无此突变。行Phaco+CTR+IOL联合二期IOL-CTR术后BCVA 0.5~0.8。行PPL+PPV+IOL术后BCVA 0.3~0.5。结论 FBN1基因c.4588C>T(p.R1530C)突变体是导致该家系的致病原因。采用一期囊袋内张力环IOL植入及二期IOL-CTR单点巩膜缝合固定术矫正IOL偏位效果较好。