目标起始密码子多态性(SCoT)分子标记技术在花生属中的应用

花生属分子标记领域的研究远落后于其他物种,而栽培种花生因其遗传基础狭窄,用大多数分子标记技术都难以检测到丰富的分子标记,因此限制了花生属野生种在改良花生栽培种方面的利用以及建立花生分子标记辅助育种技术体系。本文分别对花生属4个区组的16份种质资源和8份花生栽培种资源采用与功能基因相关的SCoT分子标记技术研究了花生属种间和栽培种内遗传多样性和亲缘关系。23条SCoT引物在花生属试材基因组中的扩增位点共194个,其中多态性位点130个,多态性达67.01%,通过聚类分析研究了它们之间的亲缘关系;在栽培种内筛选出19条多态性引物,在8份试材基因组中扩增位点198个,其中多态性位点67个,多态性为33.84%,表明SCoT分子标记技术能在花生栽培种内检测出一定程度的DNA多态性。

红豆杉种质资源遗传多样性的目标起始密码子多态性(SCoT)分析

采用目标起始密码子多态性（SCo T）分子标记技术,研究红豆杉18份种质的遗传多样性及种质间的遗传关系,为红豆杉资源的保护、利用以及遗传育种提供依据。以18份红豆杉种质资源为材料,从80条引物中筛选出19条重复性好、条带清晰的引物进行PCR扩增,利用NTSYS-pc2.10e软件对其扩增位点多态性进行分析。结果表明：19条引物共扩增出134条带,其中97条具有多态性,多态性带比率为72.39%。18个红豆杉种质间遗传相似系数在0.31-0.89之间,说明SCo T标记能够揭示材料间较高的遗传多样性。利用UPGMA进行系统的聚类分析显示,在相似系数0.53处可将18份红豆杉资源分成两大类;主坐标分析结果与聚类分析结果相一致。红豆杉资源具有较丰富的遗传多样性,SCo T分子标记技术可有效地从分子水平揭示红豆杉种质资源的遗传背景和亲缘关系。

苦荞EMS突变体库的构建及SCoT标记筛选分析

苦荞属于蓼科荞麦属1年生草本植物,药食两用,营养价值丰富.该研究以苦荞测序品种“品苦1号”为试验材料,利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变技术构建苦荞突变体库,并利用形态观察及目标起始密码子多态性(SCoT)分子标记对突变体进行了筛选分析,主要研究结果为:(1) 0.6%EMS处理12 h为“品苦1号”最佳诱变处理;(2)构建了包含966个株系的苦荞突变体库,M2代11个主要农艺性状主成分分析得到包括籽粒大小因子、籽粒形状因子、植株产量因子、植株表型因子的4大主成分因子;聚类分析将M2代群体按农艺性状的差异分为4大类;(3)利用26条SCoT引物对“品苦1号”诱变M2代群体进行PCR扩增,共得到263条清晰稳定的条带;诱变M2代与野生型之间的遗传距离在0.003 8~0.324 5之间,其中PKM2-803和对照“品苦1号”(CK)间的遗传距离最大,PKM2-097和CK间的遗传距离最小;聚类分析将966份材料分为4大类,与表型分类相似,表明EMS诱变导致苦荞在表型性状及DNA分子水平均发生了变异.

基于SRAP和SCoT标记分析不同甜樱桃品种遗传多样性

【目的】探究40个甜樱桃(Prunus avium L.)品种的遗传多样性及SRAP和SCoT标记在甜樱桃上的应用。【方法】利用SRAP和SCoT分子标记进行遗传多样性分析。【结果】筛选出6对条带清晰、多态性好的SRAP引物和7条SCoT引物,在40个甜樱桃品种中分别扩增出多态性条带67和69条,多态性百分率分别为90.54%和93.24%。SRAP标记和SCoT标记的UPGMA聚类分析表明,40个甜樱桃品种的遗传相似系数分别在0.67~0.95和0.72~0.93,说明甜樱桃的遗传背景相对较窄。SRAP标记在相似系数0.79左右可以将40份甜樱桃分为6组,SCoT标记在相似系数在0.77左右可以将40份甜樱桃分为6组。两种分子标记中,来自不同地区的甜樱桃品种没有明显聚类,说明各个地区甜樱桃品种基因交流频繁,另外大部分黄色系甜樱桃品种聚为一类。【结论】2种分子标记均可应用于分析甜樱桃遗传多样性且能够区分不同果皮颜色甜樱桃,可以作为后期种质资源利用和新品种选育的技术手段。

贵州桃种质资源遗传多样性的SCoT分析

应用SCoT分子标记技术对71份贵州桃种质进行遗传多样性分析,以期从分子水平上揭示其遗传多样性及资源间的遗传关系,为科学保存与利用贵州桃种质资源提供依据。结果表明：（1）16条引物共检测出192个位点,其中多态性位点数156个,多态性比例为81.25%,平均每条引物扩增位点为12个;供试材料Nei’s遗传多样性指数（H）为0.265 0±0.186 1,Shannon’s信息指数（I）为0.400 3±0.254 3,遗传相似系数变幅为0.400 0-0.852 5。（2）UPGMA聚类分析显示,在相似系数0.65处可将71份桃资源分成6类,其中2份白花桃资源、2份血桃资源、2份青桃资源分别为同名异物。研究认为贵州桃种质具有较丰富的遗传多样性,采用该分子标记技术区分了同名异物的桃资源。

荔枝SCoT-PCR反应体系的建立及其在遗传分析中的应用

建立适于荔枝的SCoT反应体系,并利用SCoT体系对‘紫娘喜’、‘无核荔’及其杂交后代进行真假杂种鉴定和遗传多样性分析。采用正交设计方法对影响荔枝SCoT-PCR反应的rTaq酶、Mg2＋浓度、模板DNA用量、dNTPs浓度和引物等因素进行体系优化。优化的荔枝SCoT反应体系为：20μL反应体系中含有模板DNA 30 ng,rTaq酶1 U,引物0.75μmol/L,Mg2＋3 mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L。最适退火温度为50.6℃。利用该体系对‘紫娘喜’、‘无核荔’及其杂交后代进行遗传分析,结果显示,32条引物共扩增出280个位点,多态性位点有131个,占总位点数46.78%。4条引物就可以将60株杂交后代鉴定出来。UPGMA聚类分析显示,SCoT标记能将30株杂交后代区分开,遗传相似系数在0.406-0.867,在相似系数0.68时,30株杂交后代可聚为3类。优化建立的荔枝SCoT体系结果稳定,重复性好,为荔枝遗传育种提供了新的技术支持。

多倍体枇杷SCoT分析体系的建立与优化

以软条白沙枇杷三倍体株系为试材,采用L25(56)正交设计方法,对影响枇杷SCoT-PCR反应的Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶及模板DNA用量等因素进行优化筛选,并对最适退火温度进行了探讨。建立了适于不同倍性枇杷分析的SCoT-PCR扩增体系,即20μL的优化体系中含有:Mg2+1.5 mmol·L-1,dNTPs 0.35 mmol·L-1,引物0.5μmol·L-1,Taq酶0.5 U,模板DNA 50 ng。引物最适退火温度为51.8℃。应用优化的反应体系,对32个SCoT引物和3个枇杷品种(泸州六号:2x,3x,4x,5x;龙泉1号:2x,3x,4x;早红3号:2x,3x,4x)的10个不同倍性株系进行扩增,获得了条带清晰,稳定可靠的电泳结果。

石蒜属植物SCoT-PCR反应体系构建及优化

建立并优化了石蒜属Lycoris植物的目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应(SCoT-PCR)反应体系,为研究石蒜属种质资源的遗传多样性、亲缘关系及遗传改良提供新的思路。采用L25(56)正交试验和单因素试验2种方法优化石蒜属植物SCoT-PCR体系。得出石蒜属植物SCoT-PCR最佳反应体系:DNA模板2.0 mg.L-1,引物0.125μmol.L-1,三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)0.2 mmol.L-1,镁离子(Mg2+)3.0 mmol.L-1,Taq DNA聚合酶1.0×16.67nkat。对优化的反应体系进行通用性、稳定性及可靠性检测,结果均能获得丰富、稳定、清晰的DNA谱带。最后可知SCoT新型标记在石蒜属植物中应用效果良好,可为石蒜属植物以后的研究提供基础条件。

甜菜SCoT-PCR反应体系的建立及优化

旨在利用SCo T分子标记技术为甜菜指纹图谱构建、遗传多样性分析以及其他分子标记辅助育种提供技术支持。本研究利用单因素实验优化了甜菜SCo T-PCR反应体系。结果表明,在20μL反应体系中,甜菜SCo T-PCR最优反应体系包含2.0μL的10×PCR buffer(含Mg2+)、10 ng的DNA、0.5 U的Taq DNA聚合酶、10μmol/L的引物2μL以及0.1μL的d NTPs(2.5 mmol/L each)。利用优化后的程序对12份糖甜菜品种进行扩增,结果表明,该体系扩增结果稳定、条带清晰,可用于甜菜品种指纹图谱的构建以及其他分子生物学领域的研究。

蓝莓SCoT标记分析体系的建立与优化

为建立蓝莓SCoT标记分析体系,为蓝莓的分子育种和遗传多样性分析等研究提供技术支持,以蓝莓叶片为试材,采用L16(45)正交设计方法,对影响蓝莓SCoT-PCR反应的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板DNA及引物等因素进行优化筛选,建立了适用于蓝莓遗传分析的SCoT-PCR扩增体系,即20μL的反应体系中含有:Mg2+为2.813 mmol/L、dNTPs为0.100 mmol/L、Taq酶为1.5 U、Primer为0.2μmol/L、DNA为10 ng。应用优化的反应体系,对32个SCoT引物和6个蓝莓品种(‘Centurion’、‘Premier’、‘Homebell’、‘O'Neal’、‘Tifblue’、‘Misty’)进行扩增,获得了条带清晰、稳定可靠的电泳结果。

甜菜SCoT核心引物的筛选

为了筛选出适合甜菜品种遗传多样性分析的SCoT引物,以来自8个不同国家甜菜品种为研究对象,对80条SCoT引物进行扩增,采用SCoT-PCR最优反应体系:2.0μL的10×PCR buffer(含Mg^(2+))、10 ng的DNA、0.5 U的TaqDNA聚合酶、10μmol/L的引物2μL以及0.1μL的dNTPs(2.5 mmol/L each)。结果从80条SCoT引物中筛选出20条多态性高的引物,这20条引物最多扩增出16条多态性条带,最少扩增出2条多态性条带,扩增总条带155条,其中多态性条带为134条,多态性条带的百分比为86.5%。通过对核心引物的有效性验证,表明筛选出的20个核心引物非常适合用于甜菜指纹图谱的构建。

地黄SCoT分子标记体系的建立和指纹图谱的构建

该研究采用L_(25)(5~6)正交设计和单因素两种方法,对影响地黄SCoT-PCR反应的5个因素(模板DNA浓度,引物浓度,ddH_2O和Mix的用量以及退火温度)进行了优化。结果表明:优化后的反应体系总体积为25μL,含有8μL ddH_2O,1μL模板DNA(80 ng·μL^(-1)),1μL引物(8μmol·L^(-1))和15μL Mix,退火温度为45℃。运用30份地黄种质材料,对优化的SCoT-PCR正交体系进行多次重复验证,获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,证明该反应体系稳定可靠。利用该体系对32条SCoT引物进行两次筛选,得到14个扩增产物清晰、重复性好且多态性条带相对较高的引物。利用SCoT_4等5条引物构建了上述地黄2个种共30份种质的SCoT指纹图谱。利用这5个SCoT引物指纹图谱可将7个地黄常用栽培品种区分开。这表明SCoT分子标记体系适用于地黄主要品种亲缘关系及遗传多样性的研究,所构建的指纹图谱也为地黄常见的7个栽培品种的区分提供参考依据。

利用SCoT对甜菜种质资源的鉴定及遗传多样性分析

为了研究SCoT分子标记技术对甜菜种质资源鉴定的可行性。利用80条SCoT引物对48份甜菜种质资源进行鉴别,同时对种质资源进行了遗传多样性分析和亲缘关系的鉴定。结果表明,80条SCoT引物中有6条能够扩增出清晰、且多态性高的条带,分别为SCoT1、SCoT12、SCoT13、SCoT14、SCoT17和SCoT23,其中引物SCoT1、SCoT12、SCoT14和SCoT23单独使用均可鉴别全部的48份种质资源,引物SCoT13和SCoT17共同使用可以鉴别48个种质资源;聚类分析结果表明,在遗传距离0.15处,95.8%的种质资源均聚为一类,从分子角度上表明甜菜种质资源遗传距离较小。本研究为利用SCoT分子标记技术鉴别甜菜种质资源、对种质资源进行亲缘关系鉴定、杂交组合亲本选配以及分子标记辅助育种等提供相关科学依据。

柑橘SCoT分子标记技术体系的建立及其在遗传分析中的应用

采用正交设计方法,对影响柑橘SCoT-PCR反应的Mg2＋、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶及模板DNA用量等因素进行优化,建立了适于柑橘的SCoT标记分析体系。20μL反应体系中含有：Mg2＋1.5 mmol.L-1,dNTPs 0.35 mmol.L-1,引物0.625μmol.L-1,TaqDNA聚合酶0.25 U,模板DNA 10 ng。最适退火温度为49℃。利用该体系对Wan2橘橙×Li2甜橙的杂交后代及沙田柚四倍体进行分析,扩增条带清晰,扩增产物在150~2 100 bp之间。7个引物在Wan2橘橙、Li2甜橙及其18株杂交后代中共扩增出74条带,多态性条带48条,多态性比率为64.9%,在相似系数0.85处,18株杂交后代可聚为5类,表明其具有较丰富的遗传多样性;11个引物在4株沙田柚四倍体及其二倍体亲本中共扩增出84条带,其中多态性条带46条,多态性比率为54.8%,聚类分析显示5株沙田柚遗传相似系数在0.785~0.880,在相似性系数0.825处可分为3类,3株同源四倍体分别聚在不同的位置,四倍体材料均发生了不同程度的遗传变异。研究结果表明建立的柑橘SCoT体系结果稳定,重复性好,可为柑橘遗传育种提供新的技术支持。

菊属植物SCoT分子标记技术在遗传多样性分析中的应用

采用正交设计方法,对Mg2+、dNTPs和引物浓度、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量等5个因素进行筛选,得到适于菊属植物的SCoT标记PCR反应体系,25μL体系中含有:Mg2+1.2 mmol·L-1、dNTPs 0.15 mmol·L-1、引物0.8μmol·L-1、TaqDNA聚合酶1 U、模板DNA 50 ng。优化的最适退火温度为49.4℃。改进电泳方法,采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染法染色。运用不同倍性菊属材料基因组DNA对优化的SCoT-PCR反应体系进行验证,获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,表明确立的菊属植物SCoT分子标记技术体系稳定可靠。利用该体系及筛选出的12个SCoT引物,对18份菊花近缘种属材料的遗传多样性及亲缘关系进行分析,共检测到209个位点,其中多态性位点数189个,多态性比率为90.43%。应用NTSYS-pc2.1软件,计算菊花近缘种属材料之间的相似性系数并采用不加权成对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析,结果 18份菊花近缘种属材料的遗传相似性系数范围为0.4516～0.7035,平均遗传相似性系数为0.58。聚类分析显示在相似系数0.530处可以将18份材料分成Ⅰ、Ⅱ两个大组,Ⅱ组包括芙蓉菊和绢毛蒿,其余16份材料属于Ⅰ组。Ⅰ组在相似系数0.615水平又分为6个亚组。结果表明SCoT分子标记体系适用于菊属及其近缘属种遗传多样性及亲缘关系的研究。

铁皮石斛SCoT-PCR反应体系的优化

目的对铁皮石斛的目标起始密码子(start condon targeted polymorphism,SCoT)多态性反应体系进行优化,为进一步对铁皮石斛遗传多样性的SCoT分析奠定基础。方法以铁皮石斛的新鲜叶片为试验材料,采用控制单一变量的方法分别研究模板DNA用量、引物浓度、TaqDNA聚合酶用量、dNTPs浓度、及退火温度共5个因素对SCoT-PCR扩增结果的影响。结果铁皮石斛SCoT标记的20μL优化反应体系为:DNA模板20 ng、引物浓度为30μmol/L、Taq DNA聚合酶用量为1.0 U、dNTP浓度为100μmol/L。适宜的PCR扩增程序为95℃预变性4 min;95℃变性50 s,56.1℃复性退火40 s,72℃延伸2 min,循环36次;72℃延伸5 min,4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物在600～2 000 bp。结论该体系的建立为铁皮石斛种质遗传多样性分析、分子标记辅助育种等研究奠定了基础。