利用^(15)N_(2)直接标记法研究水稻种植对稻田固氮量和固氮活性的影响

稻田固氮对土壤维持肥力有着重要的作用,但水稻种植与固氮菌及其活性之间的关系尚不清楚。本试验利用15N2直接标记法测定了下位砂姜土发育的简育水耕人为土在种水稻和不种水稻条件下的生物固氮量,及其在土壤不同层次(0~1、1~5、5~15 cm)和水稻中的分配,并通过实时荧光定量PCR技术测定了土壤中固氮菌nifH DNA及RNA基因数量。结果表明:种水稻处理显著提高了土壤各层固氮量,尤其提高了1~5 cm和5~15 cm土层土壤固氮量对总固氮量的贡献;种水稻处理的总固氮量是不种水稻处理的10.3倍;水稻植株中生物固定的氮占总固氮量的31.48%;在0~1 cm土层,种水稻处理显著提高了nifH RNA基因数量,而对nifH DNA基因数量的增加不显著。可见,水稻种植没有增加固氮菌的数量,稻田固氮量的增加是因为水稻种植极大地促进了固氮菌nifH基因的表达,提高了固氮菌的固氮活性。

基于直接标记法抗体微阵列的初步构建

目的:初步构建基于直接标记法的抗体微阵列,并评价其应用于临床的可能性。方法:选择白蛋白作为目标蛋白,通过琼脂糖铺片、玻片活化、机器点样、点样后固定等步骤构建抗体微阵列,经封闭非特异位点、标记抗原、加样后对白蛋白进行检测,对关键步骤——抗原标记进行最佳条件摸索,通过对临床标本的检测评价其潜在应用价值。结果:应用BCA蛋白定量试剂盒测定尿液样本总蛋白浓度做出的标准曲线,其R2均大于0.99;温度为37℃时抗原标记效果最佳;标记后抗原存放1周对信号的影响无统计学意义(P<0.01);本方法能够检测出临床检测为阴性的尿微量白蛋白浓度。结论:本研究构建了基于直接标记法的抗体微阵列,并对关键的抗原标记环节进行了最佳工作条件优化,有应用于临床检测的潜力。

利用^(99m)Tc直接法标记单克隆抗体及其HPLC分析

比较了２－巯基乙醇（２－ＭＥ）、二硫苏糖醇（ＤＴＴ）和抗坏血酸（ＡＡ）做为抗体还原剂进行９９ｍＴｃ直接标记ＩｇＧ的结果．以ＤＴＴ做为抗体还原剂进行了９９ｍＴｃ标记单克隆抗体３Ｈ１１及其Ｆａｂ片段研究．建立了分析鉴定９９ｍＴｃ标记抗体的ＨＰＬＣ方法．采用ＴＳＫ４０００ＳＷ为色谱性（１３μｍ，７．５ｍｍ×３００ｍｍ）和０．１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．０）为流动相，同时进行紫外检测和放射性检测，可快速地同时测定样品的蛋白质含量和标记率．

^(18)F-FDG直接标记GKLVFFGK寡肽的方法探讨

目的探讨采用18F-FDG直接标记含KLVFF序列的寡肽的方法。方法按常规制备18F-FDG,然后用其与上述寡肽进一步反应进行标记,分别采用不同pH值、不同比活度的18F-FDG、无修饰及氨基端HYNIC修饰的寡肽进行反应,分别比较标记产率。结果 pH值和18F-FDG比活度值的变化,及寡肽氨基端是否有HYNIC修饰对标记产率均有明显影响,pH值为3.0,18F-FDG比活度值为37.0 MBq/ml,在GKLVFFGK末端连接HYNIC后标记产率最高(35﹪),产物放射化学纯度达到98﹪。结论采用18F-FDG与氨基端HYNIC修饰的含KLVFF序列的寡肽具有可行性,能获得高标记产率,其合成方法可满足进一步研究和临床应用的需要。

^(99)Tc^(m)直接法标记单克隆抗体的研究Ⅱ.抗坏血酸在直接法标记过程中的作用

分析和比较了在^（９９）Ｔｃ~ｍ直接法标记单克隆抗体过程中，抗坏血酸在各个环节中的作用和影响。结果表明，在抗体还原完成后加入防氧化剂抗坏血酸可以防止还原后的—ＳＨ重新氧化，得到的标记产物在标记率和体外稳定性方面均优于不加抗坏血酸的标记法。该方法已成功地用于对Ｆ（ａｂ＇）＿２片段的标记并进行了荷瘤裸鼠体内分布和肿瘤显像测定，得到了很好的体外显像结果。

^（99m）Tc直接法标记鼠／人嵌合抗体ccM_4及在动物体内分布研究和初步临床应用

ＳｎＣｌ２还原９９ｍＴｃＯ４后与２－巯基乙醇还原的ｃｃＭ４混合标记．薄层层析测定标记率为９８％．ｃｃＭ４嵌合抗体标记前后免疫活性没有明显变化（Ｐ＞０．０５）。动物体内分布实验结果显示：注射９９ｍＴｃ－ｃｃＭ４后１２ｈ．其放射性主要分布在肾（８．１７±１．０９ＩＤ％／ｇ）．肝（６．９４±１．７９ＩＤ％／ｇ）和血液（４．０３±１．０ＩＤ％／ｇ）；荷瘤裸鼠实验显示，１２５Ｉ－ｃｃＭ４瘤体内聚集量最多。９９ｍＴｃ－ｃｃＭ４初步应用于１０例胃癌患者．

^（99m）Tc直接标记IgG及其稳定性研究

采用二硫苏糖醇还原ＩｇＧ和合亚锡的药盒还原高锝酸盐法将９９ｍＴｃ直接标记ＩｇＧ。其标记率＞９５％，标记后无需纯化。使用多种弱交换配体（亚锡ＰＹＰ、ＭＤＰ、ＧＨ、Ｐｈｙｔａｔｅ和ＥＨＩＤＡ药盒）获得了高的标记率，但此法不宜用ＤＴＰＡ药盒．体外研究和显像表明９９ｍＴｃ－ＩｇＧ的稳定性良好，可用于局部实验性脓肿的诊断。

^(99m)Tc直接标记单克隆抗体3H11及其在小鼠体内分布的研究

以二硫苏糖醇（ＤＴＴ）为抗体还原剂，亚锡ＭＤＰ药盒为弱交换配体，进行了９９ｍＴｃ直接标记ＭｃＡｂ３Ｈ１１的研究．用ＨＰＬＣ分析鉴定标记物，标记率大于９５％，标记后不需纯化．体外竞争实验和在小鼠体内分布的研究表明，由标记得到的９９ｍＴｃ－３Ｈ１１和９９ｍＴｃ－ＩｇＧ，在体内和体外均是稳定的．

^（99）Tc^m直接标记单克隆抗体的研究Ⅰ．用^（99）Tc^m标记Fab（3

总结了一种简便、可靠的直接标记法，并成功地运用此法对含巯基较少的Ｆａｂ片段进行了标记，得到了很好的标记率和体外稳定性以及较好的对荷瘤裸鼠的体内分布和显像结果。

养血透骨法对肺癌化疗后患者免疫功能影响的临床研究

目的观察透骨法对肺癌化疗后患者免疫功能的影响。方法采用直接免疫荧光标记全血溶血法、流式细胞仪技术检测治疗前后肺癌化疗后患者外周血血清T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8、NK细胞及巨噬细胞水平。结果在提升肺癌化疗后患者免疫功能方面,治疗组明显优于对照组(P<0.01)。结论透骨养血法能明显提升肺癌化疗后患者的免疫功能,并能改善其化疗后的临床症状,提高肿瘤患者生存质量,毒副反应少,具有明显的疗效优势。

多发性骨髓瘤细胞的免疫表型特点

为了解多发性骨髓瘤 (multiplemyeloma ,MM)细胞的免疫表型特点 ,采用三色免疫荧光直接标记法和流式细胞术对 2 0例MM患者的骨髓标本进行了免疫分型检测。研究结果发现 ,每例病人骨髓细胞中均可见一群异常的细胞 ;CD4 5 /SSC值较有核红细胞大 ;CD4 5阴性或弱阳性 ;CD38强阳性 ;CD19均为阴性 ;多数标本CD5 6阳性 ;少数标本胞浆κ(cκ)或胞浆λ(cλ)阳性及CD2 0阳性。检测的所有标本除三分之一为CD5 6 -外 ,均无正常浆细胞的表型 (CD19阳性 ,CD5 6阴性 )。结论 :流式细胞术是确定MM细胞的有用的方法 。

^(99)Tc^mN-DMCHI和^(99)Tc^m-DMCHI的制备及其生物分布

合成并表表征了新的异腈配体2,3 二甲基环己基异腈(DMCHI)及其铜络盐。分别通过配体交换法和直接标记法制备得到放化纯大于95%的脂溶性配合物99TcmN DMCHI和99Tcm DMCHI,二者在室温下均可稳定6h以上。在正常小鼠体内的生物分布实验结果表明,99TcmN DMCHI和99Tcm DMCHI在血液中均有较高的摄取和很好的滞留,而且血/心、血/肝和血/肺比值均大于1,有望用于心血池显像。

共检猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的cDNA芯片的技术优化

【目的】对前期构建的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和A型猪轮状病毒(PoRVA)共检cDNA芯片进行技术创新和关键参数优化。【方法】根据靶基因PEDV(S和M)、TGEV(N和S)以及PoRVA的(VP7和NSP4)分别设计6对特异性引物,扩增探针制备芯片阵列。重点改进了样品标记技术,引物直接标记与不对称PCR扩增结合,确定了不对称PCR扩增体系;并对点样缓冲液、水合时间、探针浓度、杂交时间和温度、清洗和干燥方式等条件进行优化。【结果】当博奥和百傲两种缓冲液比例为1∶1,水合时间为4 s,探针浓度为600 ng/μL,不对称PCR上下游引物比为1∶40,在48℃杂交3 h,用0.2%SDS清洗,1 000 r/min离心,该cDNA芯片效果最佳。【结论】本研究确定了PEDV-TGEV-GAR共检cDNA芯片的关键技术参数,为开展基因芯片的标准化制备和应用奠定了基础。

Flt3和c-kit在脐血CD34^+干/祖细胞中功能性表达及意义

为了解作用于早期造血的细胞因子受体Flt3和c-kit在脐血CD34^+造血干/祖细胞中的表达及功能,从蛋白和基因水平对其进行了研究。采用常规双色直接免疫荧光标记法,使用流式细胞术测定新鲜分离的和体外不同培养时间的脐血CD34^+造血干/祖细胞中Flt3和c-kit蛋白水平的表达,用RT-PCR法测定Flt3和c-kit的mRNA水平表达,并在体外对受体功能进行了探讨。研究结果显示,新鲜脐血CD34^+细胞中(68.8±15.4)％为Flt3^+,(50.6±12.7)％为c-kit^+,随着体外培养时间的延长,二者表达逐渐下降。结论:脐血CD34^+造血干/祖细胞在体外液体培养条件下Flt3和c-kit阳性表达可维持2-3周,其配体FL和SCF在培养的第1周内对细胞扩增效果最显著。

早期效应细胞因子对脐血AC133^+细胞表面趋化因子受体和粘附分子的调节作用

目的 探讨不同细胞因子组合对脐血AC133+ 细胞表面趋化因子受体 (CXCR4 )和粘附分子VLA4 (CD4 9d)表达的影响。方法 采用双色直接免疫荧光标记法 ,使用流式细胞仪测定新鲜分离的、不同培养条件下体外培养 7d的脐血AC133+ 细胞表面CXCR4和VLA4 (CD4 9d)的表达情况。结果 2 6例新鲜脐血AC133+ 细胞中CXCR4的表达率为 (46 .3± 11.5 ) % ;VLA4的表达率为(5 1.2± 17.3) %。在无血清、有细胞因子存在的条件下 ,短期液体扩增培养后 ,脐血AC133+ 细胞中CXCR4和VLA4的表达率发生变化 ,其中在早期效应细胞因子SCF、FL和TPO组合下 ,CXCR4和VLA4表达率为 (6 8.9± 15 .8) %和 (73.6± 19.8) % ,与新鲜脐血比较 ,差异非常显著 ,P <0 .0 1。结论 在体外短期扩增培养过程中 ,早期效应细胞因子能显著上调脐血AC133+ 细胞CXCR4和VLA4的表达 ;用SCF、FL和TPO组合扩增脐血 ,不仅能获得足够数量的造血干 /祖细胞 ,还能增加造血干 /祖细胞的迁移和归巢能力。

脐血造血细胞中AC_(133)抗原表达及其功能特征研究

目的 探讨AC133抗原在正常人造血细胞中表达的意义。方法 采用双色直接免疫荧光标记法 ,使用流式细胞仪测定脐血中造血细胞的免疫表型。通过祖细胞集落形成单位 (CFC)和长期培养启动细胞 (LTC IC)的测定对脐血中AC+ 133、CD+ 34 和AC-133CD+ 34 细胞的造血潜能进行了研究。结果 脐血单个核细胞 (MNCs)中AC+ 133细胞比例为 0 67% ,AC+ 133细胞中 93 4%表达CD34 抗原 ,94 2 %为PKH2 6 阳性。虽然三群细胞产生的CFC总数差异无显著性 ,但AC+ 133细胞中 5 0 %以上为粒 单集落形成单位 ,CD+ 34 、AC-133CD+ 34 细胞中 60 %和 80 %以上为红系集落形成单位。AC+ 133细胞产生的LTC IC显著高于CD+ 34 和AC-133CD+ 34 细胞。体外培养 7d ,AC+ 133细胞组细胞总数和CFC分别扩增 2 8 2和 7 1倍 ,6 8%细胞仍保持PKH2 6阳性。结论 脐血中早期造血干 /祖细胞富集在AC+ 133细胞群中 ,AC+ 133细胞在体外具有较强的增殖能力 ,既能产生大量的早期定向祖细胞 ,又能保持一定数量的早期干 /祖细胞 ,AC133抗原可作为临床分选造血干