直接竞争酶联免疫法测定呋喃妥因代谢物

目的建立动物组织中呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲的直接竞争酶联免疫(ELISA)检测法,为检测食品中呋喃妥因代谢物残留提供快速检测的方法。方法采用活化酯法制备辣根过氧化物酶标记抗原,并用棋盘法确定酶标抗原和抗体的稀释度,优化反应条件,建立检测呋喃妥因代谢物的直接竞争酶联免疫法,并对其进行方法学评价。结果该方法的线性方程为Y=-34.723X+158.01(r2=0.9922),线性检测范围为0.177~11.508ng/m L,IC50为1.291 ng/m L;猪肉、鸡肉、鱼肉的最低检测限分别为0.115、0.113、0.109μg/kg,加标回收率在82.6%~104.7%之间,批内变异系数在3.6%~9.3%之间,批间变异系数在4.3%~12.4%之间。结论本方法快速准确,适用于动物组织中呋喃妥因代谢物的检测。

直接竞争酶联免疫吸附法检测食品中三聚氰胺残留

目的采用酶标抗原建立高效、高灵敏的三聚氰胺直接竞争酶联免疫吸附法(direct competitive enzyme linked immunosorbent assay,dc-ELISA)检测食品中三聚氰胺(melamine,MEL)残留。方法以三聚氰胺单克隆抗体包被作为固相抗体,辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的抗原与标准品(或样品)中三聚氰胺竞争结合抗体,建立了直接竞争酶联免疫检测体系,以三聚氰胺标准品建立标准曲线进行定量。结果方法的IC_(50)为8.84μg/L,灵敏度为0.65μg/L,线性范围0.9~35μg/L;检测样品的回收率在70%~120%之间,与三聚氰酸交叉反应率为60%,其他结构类似物基本无交叉反应。结论本方法灵敏度高、特异性强,可以满足实际样品的快速检测需求。

直接竞争酶联免疫吸附法检测虾过敏蛋白

目的:建立酶标抗原的直接竞争酶联免疫吸附法(dcELISA)检测食品中虾过敏蛋白,为食品过敏诊断试剂的开发和应用提供理论基础。方法:提取虾主要过敏蛋白,免疫小鼠制备抗虾过敏蛋白多克隆抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗原,建立酶标抗原的dcELISA检测虾过敏蛋白。结果:所建立的dcELISA法最低检测限为3.94ng/mL,标准曲线在0.12～128.86ng/mL范围内线性良好,批内和批间变异系数分别为6.16%和2.73%,回收率为82%～98%。结论:该方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,为进一步研制检测虾过敏蛋白的ELISA试剂盒提供有效的方法。

酶联免疫法检测混合植物油中黄曲霉毒素B_1含量

目的建立酶联免疫法测定混合植物油中黄曲霉毒素B_1含量的分析方法。方法采用直接竞争酶联免疫吸附法对样品进行测定。样品经甲醇溶液提取,提取的抗原及黄曲霉毒素B_1标记物与微孔板上的黄曲霉毒素B_1特异性单克隆抗体竞争结合,洗涤除去未结合杂质。将底物加入孵育,产生蓝色产物,加入终止液终止反应蓝色产物变成黄色产物,450nm处测量吸光度。结果本方法在2h内完成混合植物油中黄曲霉毒素B_1含量的测定。黄曲霉毒素B_1的加标浓度在1.0～20.0μg/kg之间时的回收率为76.5%～120.2%,方法定量限为1.00μg/kg。结论该方法快速、准确、灵敏,适合测定混合植物油中黄曲霉毒素B_1。

牛奶中β-内酰胺酶抑制剂——舒巴坦直接竞争ELISA的分析研究

建立代表性的β-内酰胺酶抑制剂-舒巴坦直接竞争酶联免疫吸附分析法(dc ELISA)。通过对封闭液浓度、离子浓度、p H、包被条件等分析条件优化后建立dc ELISA,并进行应用。结果表明方法的IC_(50)为5.25 ng/m L,IC_(15)为1.07×10^(-3)ng/m L,板内和板间平均变异系数分别为6.69%、9.02%,对他唑巴坦和克拉维酸的交叉反应率分别是7.12%、0.93%。牛奶样品的添加回收率在85.66%~89.23%之间。该方法灵敏度较高,稳定性较好,特异性较强,可以应用于乳制品中舒巴坦残留的快速检测。

基于HRP标记抗体的黄曲霉毒素M1的直接竞争-ELISA快速检测方法

为构建快速检测乳制品中黄曲霉毒素M1(AFM1)的直接竞争-酶联免疫吸附(dc-ELISA)体系,将辣根过氧化物酶(HRP)与高纯度抗AFM1单克隆抗体进行偶联后对其与AFM1竞争性反应条件进行优化,并利用AFM1污染标准物质ERMI-BD282(0)、ERMI-BD 283(0.11μg/kg)、ERMI-BD 284(0.44μg/kg)等对检测体系的灵敏度和精确性进行验证。结果当AFM1-BSA包被质量浓度0.25μg/L、抗AFM1 mAb-HRP稀释2000倍时dc-ELISA检测AFM1的IC50为0.75μg/L,检测范围为0.015～4.05μg/L,添加AFM1至0.45μg/L的鲜奶样品中检测回收率平均为80%,dc-ELISA可满足鲜乳中AFM1国家残留限量标准0.5μg/kg的检测要求。该体系可应用于鲜奶制品中AFM 1大于0.5μg/kg污染样品的快速初筛。

饲料中T-2毒素直接竞争ELISA检测方法的建立

采用直接竞争ELISA方法建立了一种快速检测饲料样本中T-2毒素残留的方法,在0～81μg/L范围内,T-2毒素的Logit(B/B0)与T-2毒素质量浓度的对数呈显著的线性关系,并对该检测体系的检测限、准确度、精密度等性能进行了测定。结果显示,该方法的IC50(半数抑制质量浓度)为2.8μg/L,对饲料样本的检测限为10μg/kg,样本添加回收率为77.6%～98.2%,变异系数为5.1%～12.0%。该方法操作简便、准确,检测时间短(仅需15min),适用于饲料样本中T-2毒素的快速检测。

间接和直接竞争酶联免疫吸附法快速检测中药材中黄曲霉毒素B1的对比研究

该研究基于自制的抗原和抗体,对比研究了间接竞争酶联免疫吸附法(ic-ELISA)和直接竞争酶联免疫吸附法(dc-ELISA)快速检测中药材黄芪、生姜、大枣和莲子中黄曲霉毒素B1(AFB1)残留,通过考察不同样品提取方法来降低不同药用部位中药的基质效应。通过优化AFB1与HRP的摩尔比例提高dc-ELISA方法灵敏度。该研究中,ic-ELISA和dc-ELISA的灵敏度(IC_(50))分别为0.046、0.023 ng·mL^(-1),检出限(LOD)分别为0.007、0.004 ng·mL^(-1),检测时间分别为3 h、50 min,样品回收率为62.96%~104.4%,RSD<10%。53份样品中检测到3份莲子阳性样品,检测结果采用LC-MS/MS进行确证。该研究建立的2种方法准确、快速、灵敏,可用于黄芪、生姜、大枣、莲子及其他中药中AFB1的快速筛查。通过对比分析2种检测方法的优势与不足,可为检测机构和企业应用提供参考,结合实际情况选择相应的检测方法。

三种检测微囊藻毒素的ELISA方法比较研究

建立了抗原抗体复合物酶联免疫法(anti-immune complex ELISA，ICELISA)、间接竞争酶联免疫法(Indirect cELISA)、直接竞争酶联免疫法(Direct cELISA)三种检测微囊藻毒素的酶联免疫方法，确定了每种方法的检测限、线性范围以及重现性。以三种方法分别对标准品、藻样、水样及水产品中微囊藻毒素进行了测定，并对三种分析方法进行了较为系统的比较研究，为微囊藻毒素ELISA试剂盒的研制奠定了基础。

抗孔雀石绿单链抗体-碱性磷酸酶融合表达和活性鉴定

采用重叠延伸的方法成功将抗孔雀石绿(malachite green,MG)单克隆细胞的轻链VL和重链VH用连接肽(Gly_4Ser)_3连接,形成单链抗体(single chain variable fragment,scFv)基因,并将其酶切连接进入含有碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,PhoA)基因的载体plip6/GN中,成功构建重组质粒plip6/GN-MG-scFv。随后重组质粒转入大肠杆菌BL21,经诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting鉴定结果表明所获得的融合蛋白sc Fv-PhoA大小约72 kD。利用scFv与MG特异性结合的活性和PhoA催化对硝基苯磷酸二钠的显色机制,经过直接竞争酶联免疫吸附法测定融合蛋白scFv-PhoA的IC_(50)为9.81 ng/mL。本方法操作简单、灵敏度高且检测时间短,这为进一步进行MG免疫法快速检测提供了参考。

DcELISA检测泥鳅、鲫鱼中氯霉素残留方法的应用

应用直接竞争酶联免疫吸附试验方法(dcELISA)快速定量测定泥鳅、鲫鱼肌肉中氯霉素(CAP)残留量。氯霉素浓度在0.05～10ng/g范围内具有良好的线性关系,线性方程为y=-0.33-1.88x,r^2=0.995,向样品中分别添加0.1、0.3、0.9ng/g三个浓度水平的氯霉素标准品,泥鳅样品的平均回收率分别为87.2%、88.9%、93.0%。鲫鱼样品的平均回收率分别为86.1%、79.9%、99.0%,最低检测限为0.05ng/g,批内变异系数为8.0%,批间变异系数为7.2%,结果表明该方法灵敏度高,重复性好,适合在泥鳅、鲫鱼肉样中氯霉素残留筛选检测。

dcELISA检测泥鳅、鲫肌肉中氯霉素残留方法的应用

应用直接竞争酶联免疫吸附试验方法(dcELISA)快速定量测定泥鳅、鲫肌肉中氯霉素(CAP)残留量。氯霉素浓度在0.05～10 ng/g范围内具有良好的线性关系,线性方程为y=-0.33-1.88x,r^2=0.995,向样品中分别添加0.1、0.3、0.9 ng/g 3个浓度水平的氯霉素标准品,泥鳅样品的平均回收率分别为87.2%、88.9%、93.0%,鲫样品的平均回收率分别为86.1%、79.9%、99.0%,最低检测限为0.05 ng/g,批内变异系数为8.0%,批间变异系数为7.2%,结果表明该方法灵敏度高,重复性好,适合在泥鳅、鲫肉样中氯霉素残留筛选检测。