直接贴壁法体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞

取90gSPF级SD大鼠的双后肢骨髓,分别使用直接贴壁法和密度梯度离心法获得大鼠骨髓单个核细胞,用内皮培养体系EGM-2培养基进行定向诱导分化7~14d获得大鼠内皮祖细胞。免疫荧光染色和细胞功能学鉴定内皮祖细胞,观察内皮祖细胞出现的时间和数量,CCK-8法鉴定细胞的增殖能力。与密度梯度离心法相比,直接贴壁法在内皮祖细胞出现的时间、数量和增殖能力差异有统计学意义（P〈0.01）。因此,相对于密度梯度离心法,直接贴壁法培养出的内皮祖细胞分化时间更短、数量更多且增殖能力更强。

改良直接贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞及其鉴定

目的 观察并鉴定兔骨髓间充质干细胞生物特性,建立一套简单、高效的培养方法.方法 采用直接贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察其形态.MTT法测定其增殖水平并绘制其生长曲线.流式细胞仪测定第三代骨髓间充质干细胞表型.结果 细胞培养第5d,镜下见细胞呈小集落生长,形态呈多边形;7～8 d小集落融合成大集落,10d左右可传代.第二代细胞镜下呈梭形成纤维样细胞,即间充质干细胞;细胞生长曲线成S形;流式细胞仪检测细胞表达CD 73、CD 90、CD 105、不表达CD 34、CD 45.结论 改良直接贴壁法可获得大量、纯化、稳定的间充质干细胞.

骨髓间充质干细胞分离培养方法及其对CD8＋T淋巴细胞的免疫调控

背景:骨髓间充质干细胞具有免疫调节特性,使其在免疫抑制方面有可预期的应用价值。目的:探讨骨髓间充质干细胞的分离培养方法及其对CD8^+T淋巴细胞的免疫调控。方法:采用骨髓直接贴壁法获得原代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,利用差速贴壁结合消化法纯化原代细胞,加入Ⅰ型胶原蛋白作为细胞外基质,扩增骨髓间充质干细胞。取第2代骨髓间充质干细胞,分别将0,1×10~3,1×10~4,1×10~5/well的骨髓间充质干细胞与CD8^+T淋巴细胞共培养,植物血凝素刺激68 h,荧光CFSE法观察CD8^+T淋巴细胞聚集,MTT法检测CD8^+T淋巴细胞增殖率。结果与结论:(1)不同密度骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞均有抑制作用,1×10~3/well组抑制能力最弱,形成集落现象;1×105/well组抑制能力最强,细胞未见明显聚集现象;(2)1×10~3,1×10~4,1×10~5/well组CD8^+T淋巴细胞增殖率分别为(44.83±4.92)%、(31.94±6.28)%及(15.77±3.98)%,3组间两两比较差异均有显著性意义(P<0.05);(3)结果表明,采用全骨髓直接贴壁法能获得原代大鼠骨髓间充质干细胞,采用差速贴壁联合消化控制法能完成细胞纯化,骨髓间充质干细胞浓度依赖性抑制T淋巴细胞增殖。

人脐带间充质干细胞的高效分离及对小鼠免疫功能的影响

目的建立一种从健康人脐带中分离间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的简单、经济、高效方法,并探讨其对小鼠免疫细胞的影响。方法取经剖宫产获得的健康人脐带血管与外膜之间的胶状物并剪切成小于1 mm3的小块,用组织块贴壁法直接培养MSCs,并用获得的MSCs注射于健康C57 BL/6小鼠皮下。结果获得的MSCs高表达CD105、CD73、CD44和CD90,不表达CD34、CD45和人类白细胞抗原-DR,符合干细胞的各种生物学特性。结论用简便、经济的方法获得了健康人脐带间充质干细胞,注射C57 BL/6小鼠体内后,小鼠的血细胞及T细胞亚型未改变,自身免疫系统稳定,为进一步的研究奠定了实验基础。