肿瘤坏死因子受体相关因子6对卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染后促炎因子的影响

目的通过体外培养观察肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)沉默和过表达后促炎因子白细胞介素(IL)-1α、IL-1β、IL-6、IL-8的表达,探索TRAF6对卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)感染后促炎因子的影响,为KSHV致病机制的研究提供新思路。方法使用KSHV(+)iSLK细胞系建立沉默和过表达TRAF6模型,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测转染水平。细胞培养48、72 h后通过酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测促炎因子的表达,并比较TRAF6沉默及过表达后促炎因子表达水平的变化。结果成功建立TRAF6沉默(siTRAF6)和TRAF6过表达(TRAF6-OE)细胞模型。ELISA结果显示,TRAF6沉默后促炎因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8表现出不同程度的升高,TRAF6过表达后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8有不同程度的降低,且IL-6、IL-8变化幅度较大,说明TRAF6对促炎因子有一定的抑制作用,提示其在KSHV感染后促炎作用的信号通路中发挥重要作用。结论TRAF6对促炎因子有一定抑制作用,有望作为新的潜在靶点抑制卡波西肉瘤病情发展。

卡波西肉瘤相关疱疹病毒诱导代谢重编程的致瘤机制研究进展

卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是一种与多种类型人类恶性肿瘤密切相关的致癌γ疱疹病毒。KSHV相关肿瘤的抗病毒药物局限,患者对常用的抗病毒药物存在明显的异质性,且并不总是对KSHV诱发的疾病有效,因此亟需寻找不同分子机制的合适靶点来治疗KSHV相关疾病。KSHV通过基因及编码的致癌蛋白、信号通路直接或间接调控糖酵解代谢与氨基酸代谢,通过促进脂肪酸合成和过氧化物酶体对脂质代谢进行调控,进而促进KSHV潜伏裂解期病毒粒子复制、存活、转化和诱导血管生成等影响肿瘤的发生和治疗效果。此外,靶向KSHV诱导代谢过程中的基因、信号通路、代谢调节因子和代谢物在有关体内体外实验的研究中,有显著的抗病毒和抑瘤效果,表现出具有成为治疗靶点的潜力。对KSHV诱导代谢重编程的致瘤作用及机制的认识可以为其相关疾病的治疗提供理论依据。本文对KSHV诱导糖酵解代谢、氨基酸代谢和脂质代谢发生的异常改变和分子机制,以及基于KSHV诱导代谢重编程的相关潜在治疗靶点进行了综述。

藤茶提取物对卡波西肉瘤相关疱疹病毒裂解复制及相关淋巴肿瘤细胞生长活性的影响

目的:观察藤茶水提取物(AGE)对卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)裂解复制的影响,检测AGE抗KSHV相关淋巴瘤的安全性和细胞特异性,探索其可能的细胞通路机制。方法:采用组织型纤溶酶原激活剂(TPA)诱导人卡波式肉瘤相关疱疹病毒感染细胞系(BCBL-1)中的KSHV裂解复制,用AGE制备的低、中、高浓度溶液处理48~72 h,随后收集细胞样品,逆转录PCR(RT-PCR)检测KSHV潜伏基因LANA、即时早期基因RTA和ORF45以及晚期基因K8.1的转录水平;实时荧光定量PCR检测KSHV子代病毒含量;蛋白质免疫印迹法(WB)检测KSHV潜伏蛋白LANA、裂解蛋白RTA、ORF45和K8.1的表达及KSHV裂解复制中相关信号通路蛋白激酶B(Akt)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、丝裂原活化蛋白激酶p38抗体(p38 MAPK)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的活化水平;噻唑蓝比色法(MTT)检测AGE对BCBL-1和正常外周血单个核细胞(PBMC)的细胞毒性。结果:与对照组比较,低浓度AGE对潜伏基因LANA、即时早期基因RTA和ORF45的转录无明显抑制作用,对晚期基因K8.1的转录具有轻微的抑制作用(P<0.05);中浓度AGE对LANA、RTA和ORF45的转录具有轻微的抑制作用,并显著抑制K8.1的转录(P<0.05,P<0.01);高浓度AGE对LANA、RTA的转录无明显抑制作用,但显著抑制即时早期基因ORF45和晚期基因K8.1的转录(P<0.01)。20μg/mL浓度AGE能抑制73%子代KSHV颗粒的产生。与对照组比较,低、中、高浓度AGE对潜伏蛋白LANA的表达抑制均不明显,但对裂解蛋白RTA、ORF45和K8.1的表达均有不同程度的抑制作用(P<0.05,P<0.01,P<0.001),且呈剂量依赖性抑制。低、中、高浓度的AGE对Akt的磷酸化均没有明显的抑制作用,但对mTOR(2448)、ERK1/2和p38 MAPK(180/182)的磷酸化均有明显抑制作用(P<0.01,P<0.001)。100μg/mL的AGE显著抑制BCBL-1细胞的生长,最大细胞抑制率为67.7%,AGE对PBMC最大细胞抑制率为37.0%。BCBL-1细胞在潜伏期和裂解期的半数毒性浓度(CC50)分别为(25.7±0.5)μg/mL和(31.8±8.6)μg/mL,AGE对KSHV子代产生的半数抑制浓度(IC50)抑制作用小于10μg/mL,PBMC的CC50为49.54μg/mL。结论:高效低毒的天然植物药藤茶是潜在的治疗KSHV感染和相关淋巴瘤的有效药物来源,其抗KSHV作用可能与抑制ERK/MAPK/mTOR通路活化有关。

安徽蚌埠地区卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的血清阳性率研究

目的研究安徽蚌埠地区卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)在普通人群中的感染情况,并初步分析KSHV感染的危险因子。方法选择KSHV ORF65、ORF73和K8.1编码的病毒蛋白为抗原,采用酶联免疫法对1 008份普通人群血清进行了KSHV抗体检测。结果在检测的1 008份血样中,KSHV抗体的总阳性率为4.3%,其中男为3.9%,女为4.6%。统计学分析结果显示,KSHV感染率没有性别差异,在年龄上也基本无差异。结论在中国安徽北部地区的普通人群KSHV的感染率较低,且KSHV的感染与年龄及性别之间无明显相关性。

卡波济肉瘤相关疱疹病毒编码IL-6基因的分离克隆及在NIH3T3细胞中的表达研究

目的:分离克隆卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)编码IL-6基因(vIL-6),并导入NIH3T3细胞中进行真核表达。方法:根据KSHV编码IL-6基因核苷酸序列设计一对引物,在引物的5′端分别引入BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增vIL-6基因,PCR产物经双酶切克隆进真核载体pcDNA3.1(+)。进一步在原有的下游引物5′端加上一段flag序列,以经过序列测定正确的重组质粒为模板,PCR扩增vIL-6-flag融合基因,构建含vIL-6-flag的重组质粒。将该质粒转染NIH3T3细胞,经G418筛选获细胞抗性克隆。最后用抗flagM2单克隆抗体进行Westernblot检测vIL-6在NIH3T3细胞中的表达。结果:获得vIL-6-flag融合基因,全长671bp,其中vIL-6基因核苷酸序列与GenBank中所登记的KSHVvIL-6基因呈现100%同源性。Westernblot结果显示,在约25ku位置有目的条带,与预期的重组vIL-6-flag融合蛋白大小一致。结论:KSHVvIL-6编码基因在NIH3T3细胞中初步获得表达。

甘肃省敦煌地区普通人群卡波肉瘤相关疱疹病毒感染的血清学分析

目的研究卡波肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)在甘肃敦煌地区普通人群中的血清阳性率,并分析KSHV感染的危险因素。方法随机收集1 000例敦煌地区普通人群血清,以KSHV 3个基因片段orf65、orf73、orf k8.1编码蛋白为抗原,间接ELISA检测样本中KSHV抗体,SPSS软件分析危险因素。结果 1 000份血清中,KSHV抗体总阳性率为19%,男性阳性率(22.9%)高于女性(16.6%)(P=0.016);KSHV感染与梅毒螺旋体(P=0.004)和丙肝病毒(P=0.027)感染间有相关性,而与年龄、乙肝五项无关。多因素Logistic回归分析显示梅毒螺旋体感染的OR(95%CI)为10.142(1.920~53.577)。结论甘肃敦煌地区普通人群中KSHV的感染率较高,且与性别有关;梅毒螺旋体感染是该地区KSHV感染最重要的独立危险因素。

卡波济肉瘤相关疱疹病毒包膜糖蛋白K8.1B全长cDNA的克隆及在真核细胞中的表达

目的:分离、克隆卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白K8.1B全长cDNA,并将其置于真核细胞中进行表达。方法:用K8.1B基因设计一对PCR引物,其5’端分别引入BamHI和XhoI酶切位点。以佛波酯(TPA)刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增KSHVK8.1B编码序列,经双酶切后克隆进pcDNA3.1(+)载体中,构建含K8.1BcDNA的重组真核表达质粒。重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后转染人胚肾293细胞,经G418筛选获细胞克隆。用间接免疫荧光染色(IFA)检测K8.1BcDNA编码蛋白在293细胞中的表达状况。结果:RT-PCR分离、克隆的K8.1BcDNA全长501bp,核酸序列分析显示,该基因与Genbank中已登记的K8.1B编码基因呈现100%同源性。经IFA证实该重组蛋白为KSHVK8.1B特异性蛋白。结论:KSHV包膜糖蛋白K8.1B编码cDNA在293细胞中获得了正确表达。

湖北地区普通人群卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染的血清学分析

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)可导致人类产生卡波氏肉瘤(KS),即AIDS病人最为常见的肿瘤。广泛的流行病学研究显示,KSHV的流行与KS相似并呈现明显的地域分布型。为调查KSHV在汉族普通人群中的感染情况,我们以KSHVORF65编码的小衣壳蛋白(smallcapsidprotein)为抗原,采用酶联免疫(ELISA)分析方法,对湖北地区560例汉族普通人群血清样品进行了KSHV抗体检测。在检测的560份血样中,KSHV抗体总阳性率为5.2%,其中,男性阳性率为5.7%,女性为4.5%。统计学分析显示,KSHV感染率在男女性别上无差异(P=0.542),但与年龄有一定的相关性:10岁以下儿童群体较之10岁以上人群KSHV感染率具有显著的统计学差异(P=0.006,OR=6.692,95%CI=1.710-26.198);60岁以上的老年人群KSHV感染率有上升趋势,但无统计学明显差异(P=0.052)。上述结果表明,KSHV在这一地区的流行与西方成年人群的感染率相似,但在儿童群体中的相对较高的感染率与一些非洲地区的接近。由此提示在该群体可能存在特殊的传播模式。

卡波肉瘤相关疱疹病毒ORFK12蛋白初步研究

目的研究卡波肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)ORFK12基因在大肠杆菌的表达及表达的蛋白在普通人群中检测KSHV的感染情况。方法设计一对特异性引物,以BCBL-1细胞总DNA为模板,采用PCR方法扩增KSHV ORFK12基因。构建含目的基因的重组质粒命名为PQE-80L-K12和诱导蛋白表达。采用ELISA法和Western blot法筛查临床收集的血清标本中感染KSHV的情况。结果异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后的PQE-80L-K12重组菌经十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示有一个约10 ku的融合表达蛋白为ORFK12蛋白。采用ELISA法和Western blot法检测显示ORFK12蛋白能与KSHV阳性血清反应。结论 KSHV ORFK12基因在大肠杆菌中表达,表达的ORFK12蛋白在实验室检测感染KSHV有一定的辅助作用。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒vGPCR具有巯基化酪氨酸的氨基端的表达和纯化(英文)

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)编码的G-蛋白偶联受体(vGPCR)基因是一种癌基因,在KSHV致瘤过程中起着重要作用.前期工作揭示vGPCR的氨基端Y26和Y28两位酪氨酸的巯基化作用对其致瘤性至关重要.本研究将vGPCR的氨基端(1～49位氨基酸)以及其yydd突变体分别同鼠Fc片段有机连接并命名为wt-vG-N-mFc和yydd-vG-N-mFc.采用该两种重组质粒分别转染HEK293T细胞,重组融合蛋白分别从全细胞裂解液和细胞培养液中被纯化出来,并被考马斯亮蓝和印迹杂交鉴定.放射自显影表明wt-vG-N-mFc而非yydd-vG-N-mFc具有巯基化修饰作用.含有巯基化酪氨酸的vGPCR氨基端融合蛋白的成功表达和纯化为其将来在研究vGPCR的致瘤性和以vG-PCR为靶定目标的临床治疗中的应用打下了基础.

卡波济肉瘤相关疱疹病毒包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体的鉴定

目的:对已制备并经初筛的卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体进行特异性鉴定。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA),经3次克隆选择,筛选出能稳定分泌针对K8.1蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株共9株。采用Westernblot法评价9株杂交瘤细胞培养上清识别原核表达重组K8.1蛋白和原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1中KSHVK8.1包膜糖蛋白的能力。结果:筛选了9株能够稳定分泌抗K8.1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;Westernblot法显示,9株单抗均能特异性识别原核表达K8.1/GST融合蛋白和BCBL-1中KSHVK8.1包膜糖蛋白。结论:成功制备了KSHV包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体。

卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染前列腺上皮细胞并激活Wnt信号通路的初探

目的:研究卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是否能够感染前列腺非致瘤性上皮细胞系RWPE-1及前列腺癌细胞系PC-3,并初步探索其相关信号通路变化。方法:将12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)刺激人原发性渗出性淋巴瘤细胞系BC-3,收集细胞上清(含KSHV病毒颗粒),感染RWPE-1及PC-3,观察前列腺细胞的细胞病变效应(CPE)。采用RT-PCR检测KSHV即刻基因ORF50 mRNA转录状况;进一步运用Western blot检查病毒裂解期产物病毒白细胞介素6(vIL-6)的蛋白表达水平;最后采用Western blot法检测被感染细胞胞浆和胞核中β-catenin表达水平。结果:PC-3细胞感染KSHV后未见明显CPE,但RT-PCR和Western blot均在预期位置检测到KSHV基因ORF50和vIL-6的mRNA及其编码的蛋白条带。RWPE-1细胞感染KSHV后可出现明显的CPE,感染后24h可以检测到vIL-6的表达。Wnt通路蛋白β-catenin在感染KSHV的RWPE-1细胞胞浆和胞核均呈上升趋势。结论:KSHV可以感染前列腺细胞系并有可能激活Wnt通路。

百色市献血人群中卡波氏肉瘤相关疱疹病毒DNA的套式PCR检测

目的了解百色市献血人群中卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的流行状况。方法收集百色市部分无偿献血者肘静脉抗凝血474份,其中男259份,女215份,采用套式聚合酶链反应(n-PCR)方法对474例样本所提取的DNA进行KSHV特异性序列扩增,1.5%琼脂糖凝胶电泳,出现168bp条带为阳性结果。结果 474名献血者中9例阳性,阳性率1.90%;其中男性献血者中检出阳性者5例,阳性率为1.93%;女性献血者中检出4例,阳性率为1.86%。男女两组间阳性率采用χ2检验,差异无统计学意义(P>0.05)。结论百色市献血人群中存在KSHV的感染,不同性别献血者感染率差异无显著性。

卡波济肉瘤相关疱疹病毒体外感染人牙龈成纤维细胞初探

目的:探索卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)体外感染人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF)的途径和方法,为研究KSHV导致口腔卡波济肉瘤病变的机制提供依据。方法:用12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)刺激人原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)细胞系的BC-3细胞,收集细胞上清(含KSHV病毒颗粒),感染HGF细胞。观察细胞病变效应(cytopatric effect,CPE),采用RT-PCR和Western blot分别检测HGF细胞内KSHV编码基因的转录情况和蛋白表达水平。结果:KSHV感染HGF细胞后可出现CPE;感染后采用RT-PCR可检测到不同时间点ORF26和ORF73基因的转录;感染后12 h可检测到vIL-6蛋白的表达。结论:KSHV可感染HGF细胞并建立潜伏感染,为进一步研究KSHV导致的口腔KS发病机制提供了较好的体外模型。

卡波济肉瘤相关疱疹病毒潜伏相关核抗原编码基因的克隆及表达

目的:分离卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)潜伏相关核心抗原(LANA)羧基端基因(ORF73C),并在大肠杆菌中克隆和表达。方法:设计一对PCR引物,在引物的5′端分别引入BamH I和EcoR I酶切位点,提取稳定状态的BCBL-1细胞的总DNA作模板,通过PCR扩增KSHV ORF73C,PCR产物经双酶切后按正确的读码框克隆进原核表达质粒pGEX-6p-1中,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果:经核酸序列测定及分析,分离、克隆的ORF73C基因与基因数据库中登记的ORF73基因的羧基端的621bp的序列有99％同源性。经IPTG诱导的重组质粒转化菌体SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳显示有大小约为46ku的融合蛋白表达。结论:初步表明ORF73C基因在大肠杆菌中获得正确表达。

人疱疹病毒8型—Kaposi肉瘤相关疱疹病毒及其相关疾病的研究进展

Kaposi肉瘤相关疱疹病毒 ,又称人疱疹病毒 8型 ,是近来发现的一种新的肿瘤病毒 ,它参与了Kaposi肉瘤的发病机制 ,并与某些血液疾病 ,如原发性渗出性淋巴瘤及多中心Castleman病等有关。此病毒的一系列病毒基因能干扰细胞的生长和分化 ,但确切的致瘤因素仍在研究中。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒ORF65抗体的制备及其特异性检测

目的制备高效价卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)病毒ORF65衣壳蛋白抗体并检测其特异性。方法将人工合成的ORF65蛋白抗原肽经弗氏佐剂乳化,在家兔背部、颌下等皮下多点免疫注射,间隔2周免疫,共4次。末次免疫后1周取兔血清,ELISA法检测兔免疫血清抗体IgG抗体水平。进一步采用免疫荧光、Western blot检测制备的抗血清中与ORF65结合的特异性。结果家兔在全程免疫后产生了高效价的特异性抗体,最高滴度达1∶12 800。免疫荧光检测显示,与未经佛波酯(TPA)刺激的BCBL-1细胞相比,兔抗血清主要结合于BCBL-1细胞胞质,与ORF65蛋白在细胞内表达位置一致。Western blot结果显示在21kD处有特异性蛋白条带,其大小与预期的ORF65蛋白大小相符,同时经TPA刺激的BCBL-1细胞中ORF65蛋白表达量高于对照组,与ORF65蛋白裂解期蛋白的特性相符。结论用ORF65衣壳蛋白抗原肽段免疫家兔,可成功制备高效价的特异性抗血清,该抗体可与KSHV病毒ORF65蛋白特异性结合。

IL-10、IL-4及其受体启动子在人类单纯疱疹病毒1型激活卡波济肉瘤相关疱疹病毒复制过程中的启动活性分析

目的:分离和鉴定人类IL-10、IL-10受体(IL-10Rα)、IL-4及其受体IL-4Rα启动子序列,并分析IL-10、IL-4以及其受体的启动子在人类单纯疱疹病毒1型(HSV-1)激活卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)过程中的启动活性。方法:以人类基因组DNA为模板,PCR扩增IL-10、IL-10Rα、IL-4Rα启动子区序列,并分别克隆载入pGL-3基本载体中虫荧光素酶(Luciferase)报告基因的上游。进一步将上述构建的重组质粒与本室保存的含IL-4启动子重组质粒分别转染HSV-1感染的BCBL-1细胞,并作Luciferase活性检测。结果:分离了IL-10、IL-10Rα和IL-4Rα的启动子区域序列,并成功克隆了含启动子序列重组报告质粒;HSV-1感染的BCBL-1细胞在进一步转染了IL-10、IL-10Rα、IL-4和IL-4Rα启动子重组报告质粒后,其Luciferase值与相应的对照比较显著升高(P<0.05)。结论:在BCBL-1细胞中,HSV-1可通过直接激活IL-10、IL-4以及相应受体的启动子来上调它们的表达;在HSV-1感染的BCBL-1细胞中,IL-10和IL-4可能对KSHV的裂解复制起到促进作用。

宫颈病变卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染状况分析

目的:了解宫颈病变卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)感染状况,探讨KSHV感染与宫颈病变的关系方法:选择组织学确诊为宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌(SCC)的病例440例作为研究组,同区域、同期就诊或体检并排除有宫颈病变的女性380例为对照组,分别采集血液和宫颈脱落细胞标本,提取DNA,巢式PCR检测KSHV ORF26,核酸电泳观察结果结果:研究组血液样品KSHV检出率12.9%(53/412),对照组检出率6.5%(23/354),两组差异有统计学意义(P<0.01),但宫颈脱落细胞样品中未能检出KSHV;对研究组作分层分析,KSHV检出率随年龄增加、宫颈病变程度加重而升高,差异有统计学意义(P<0.05)结论:宫颈病变女性KSHV检出率高于正常女性,感染率随宫颈病变程度加重而升高。