恙虫病东方体Karp株相对分子质量为47蛋白基因的克隆与表达

目的了解恙虫病东方体Karp株相对分子质量为47蛋白的表达,检测其抗原性和免疫原性。方法采用PCR扩增恙虫病东方体Karp株相对分子质量为47蛋白成熟肽全基因序列并TA克隆,酶切PCR产物构建pGEX-47原核表达质粒,转化BL21,IPTG诱导表达相对分子质量为47重组蛋白,并检测其抗原性及免疫原性。结果1.扩增PCR产物约1300bp,测序结果与相对分子质量为47蛋白基因序列相同;2.构建原核表达质粒pGEX-47,纯化的重组蛋白SDS-PAGE分析在相对分子质量为47处,薄层扫描分析表达率为15.8%;3.Dot blot分析显示其有抗原性,小鼠免疫实验证实其有免疫原性。结论扩增相对分子质量为47蛋白的成熟肽全基因序列,在原核细胞得到表达,表达产物具有抗原性和免疫原性。

鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体的构建

目的 构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体。方法 应用重组ＤＮＡ技 术，将人工合成的尿激酶原信号肽基因与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对分子质量单链尿激酶融合基因连接，并保 证在同一阅读框架，然后分别插科到pcＤＮＡ３和ＰＭＪＫ３两种真核表达载体中。结果构建成可以在真核细胞中分泌表 达鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的重组质粒pcＤＮＡ３－Ｄ１和ｐＭＪＫ３－Ｄ１。结论为建 立稳定分泌表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的细胞工程株奠定了基础。

膜联蛋白32与低分子质量单链尿激酶融合基因的构建及高效表达

目的：构建膜联蛋白32（annexin32，Anx32）和低相对分子质量单链尿激酶（ScuPA32k）的融合基因，并在大肠杆菌系统内作表达。方法：利用重叠区扩增法进行基因拼接，然后在谷胱甘肽S转移酶原核表达系统内表达，Western印迹验证表达产物。结果：重叠区扩增得到 1．8 kb融合基因，该基因在原核表达系统内得到高效表达，表达量占菌体总蛋白的 26％，Western印迹证明表达产物正确。结论：用重叠区扩增法进行基因拼接快速、简便。

Tat_(47-57)-HBcAg融合基因表达载体的构建及融合蛋白的表达鉴定

目的:探讨融合蛋白Tat47-57-HBcAg原核表达的可行性,并分析其表达形式,为研究其功能提供理论基础。方法:合成Tat47-57编码序列,PCR技术扩增HBcAg基因,通过重叠延伸PCR片段拼接法,将Tat47-57编码序列和HBcAg基因拼接,将融合基因克隆到pET28原核表达载体中。挑选测序正确的构建质粒转化大肠埃希菌Rosetta-gamiTM2(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导融合蛋白表达,表达产物超声破壁,十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析融合蛋白的表达形式,Western印迹鉴定。结果:Tat47-57-HBcAg融合蛋白在大肠埃希菌中主要以可溶性形式过度表达,Western印迹分析表明Tat47-57-HBcAg融合蛋白可与HBcAg单克隆抗体反应。结论:融合蛋白Tat47-57-HBcAg以可溶性形式在原核表达系统中高效表达,并能特异性的被HBcAg单克隆抗体所识别。

多溴联苯醚-47对淡水背角无齿蚌热休克蛋白基因表达的影响

为了探讨多溴联苯醚-47(PBDE-47)对背角无齿蚌(Anodonta woodiana)慢性毒性效应,克隆了背角无齿蚌热休克蛋白基因(AwHSP60),分析基因全长、开放阅读框、编码、氨基酸。研究发现AwHSP60具有HSP60家族的标签序列;荧光定量PCR分析表达显示,AwHSP60基因广泛分布于斧足、鳃、肝胰脏、闭壳肌、心脏、血淋巴和外套膜,PBDE-47处理后肝胰脏中AwHSP60 mRNA水平在第1-15天显著性增加了89.9%,鳃中AwHSP60 mRNA水平显著性增加了2.09倍,血淋巴中AwHSP60 mRNA水平显著性增加2.13倍。结果表明,背角无齿蚌上调AwHSP60表达有助于增强动物对PBDE-47处理的耐受能力。

蜡样芽孢杆菌A47鞭毛蛋白基因的克隆及其定殖相关性初探

植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内, 并与寄主植物建立一定和谐关系的一类微生物。诸多研究结果表明,部分植物内生细菌对植物是有益的,因此,目前对植物内生细菌的研究已成为国内外研究的热点之一。蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)A47是本实验室从小麦根部分离的一株内生增产细菌。它可以在小麦的根围和根内定殖,但其定殖机理目前尚不清楚,本研究从该菌的鞭毛蛋白基因入手,克隆该基因并采用插入突变方法获得突变菌株,再比较突变菌株与野生菌株之间的差异,为明确细菌的定殖因子做一些初步探索。由鞭毛蛋白基因的同源序列设计引物,以蜡样芽孢杆菌A47的基因组DNA为模板,扩增获得了两个鞭毛蛋白基因,分别命名为flaA和flaB;

大鼠热休克蛋白47真核表达载体的体外构建

目的:体外构建大鼠热休克蛋白47(47kDa heat shock protein,HSP47)的荧光真核表达载体,并检测其在鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3中的表达。方法:应用RT-PCR方法从大鼠肝脏中分离、扩增目的片断,双酶切定向克隆到真核表达载体pTracer-CMV中,构成重组质粒pTracer-CMV-HSP47,测序验证。通过脂质体介导质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,Western blotting和免疫细胞化学检测HSP47及Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)的表达变化。结果:通过RT-PCR获得1.3kb的cDNA片断,测序发现除个别碱基差异外,其余cDNA序列与基因库(Genebank)中序列一致,且编码的氨基酸序列完全一致。转染后经Western blotting和免疫细胞化学检测证实HSP47和collagenⅠ表达明显增强。结论:本研究成功构建了大鼠HSP47荧光真核表达载体pTracer-CMV-HSP47,并能在NIH/3T3细胞中表达,同时证实HSP47能促进collagenⅠ的表达。

热休克蛋白47重组质粒对糖尿病大鼠皮肤创口愈合影响的实验研究

目的:初步研究热休克蛋白47(HSP47)重组质粒pTracer-CMV-HSP47局部注射对糖尿病大鼠皮肤创口愈合的影响,探讨以HSP47质粒为基础的基因治疗促进糖尿病皮肤创口愈合的可行性和有效性。方法:制备四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠皮肤创口愈合模型,创缘皮下局部注射HSP47重组质粒,观察其对皮肤创口愈合的影响,并用免疫组织化学、荧光定量RT-PCR、Western blotting检测创口愈合过程中HSP47和collagen I的表达变化。结果:在糖尿病大鼠皮肤创缘连续两次注射质粒后第3、6、9天,免疫组织化学、荧光定量RT-PCR和Western blotting检测证实,HSP47重组质粒组比对照组能显著增加创口中的HSP47和collagenⅠ的表达。结论:在糖尿病大鼠皮肤创口周围注射质粒pTracer-CMV-HSP47,能明显增强HSP47和collagenⅠ的表达,有助于改善创口愈合,HSP47可能是促进糖尿病皮肤创口愈合的潜在治疗靶点。

恙虫病东方体Karp株47kDa蛋白成熟肽的克隆与表达

目的 :克隆表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株 4 7kDa表面蛋白的成熟肽 ,探索其作为疫苗及诊断抗原的可能性。方法 :采用PCR方法 ,从 OtKarp株菌种基因组DNA中扩增出 4 7kDa成熟蛋白基因片段 ,将该片段克隆于原核表达载体pQE30 ,构建成重组质粒pQE30 4 7,转化大肠杆菌 (E coli) ,经IPTG诱导表达 ,SDS_PAGE和Western_blotting检测目的蛋白的表达。结果 :①获得长约 12 72bp的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因 ;②SDS_PAGE和免疫印迹显示该重组质粒转化的E coli有一相对分子量约为 4 3× 10 4 的独特蛋白带 ;③重组表达质粒序列分析结果显示pQE30 4 7中插入的基因片段的序列与已报告的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因序列基本一致 ,并与已知序列相同。结论 :获得了OtKarp 4 7kDa蛋白基因 ,并在E coli中实现了表达 。

热休克蛋白47和热休克蛋白60在小鼠胚胎器官形成过程中的表达

目的:研究小鼠胚胎器官形成过程中热休克蛋白47(Hsp47)和热休克蛋白60(Hsp60)的表达情况。方法:于GD11- GD18,取得小鼠胚胎脑、眼、心、肺、胃、肝、四肢,于GD13-GD18取得肾,利用RT-PCR方法半定量检测Hsp47和Hsp60在各器官的表达丰度。结果:Hsp47在GD11-GD12和GD18的脑、GD11-GD12和GD17-GD18的眼、GD11-GD12和GD16- GD18的肺、GD11-GD18的肝脏不表达,在其余时间和其余器官均有表达;Hsp60在GD11-GD18时段胚胎的脑、眼、心、肺、胃、肝、肾(GD13-GD18)、四肢中均有表达。结论:Hsp47和Hsp60在小鼠胚胎器官形成过程中有不同的表达丰度,其表达模式也不一致;Hsp47在小鼠胚胎发育过程中可能有重要功能,Hsp60则具有广泛表达的特点。

阵发性睡眠性血红蛋白尿患者外周血细胞CD47的表达

目的:通过研究阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者外周血细胞CD47的表达,探讨CD47在PNH发病机制中的作用。方法:选取PNH患者8例,正常对照组15例,以逆转录-聚合酶链反应异源双链分析银染法进行PIG-A基因检测,流式细胞术检测外周血细胞表面CD47、CD59的表达。结果:6例PNH患者PIG A基因第2外显子有碱基变异,其余2例未发现异常;PNH患者外周血红细胞、粒细胞CD47表达阳性率及平均荧光强度比正常对照组均减低(P<0．05)。结论:PNH患者外周血细胞表面CD47表达减少,CD47的表达与PNH发病机制可能有关。

低氧胁迫与常氧条件下斑马鱼鳃中热休克蛋白基因家族的表达差异比较

为研究斑马鱼热休克蛋白(HSP)应对低氧胁迫的生物学功能,对低氧胁迫与常氧条件下斑马鱼Danio rerio鳃组织进行转录组测序,利用实时荧光定量RT-PCR技术检测了低氧胁迫与常氧条件下斑马鱼鳃中热休克蛋白家族基因的表达差异。结果表明:在参与比较的斑马鱼鳃转录组测序中,共找到80个热休克蛋白家族基因成员;在低氧与常氧条件下鳃中热休克蛋白家族中有28个基因表达呈明显变化,其中16个基因表达量显著上调(P<0. 05),12个基因表达量显著下调(P<0. 05); Hsp47基因是低氧胁迫下表达量增加最明显的热休克蛋白基因,Hsp90ab1基因是低氧胁迫下唯一表达量升高的大分子热休克蛋白基因;低氧胁迫下Hsp47在鳃、肌肉中的表达极显著升高(P<0. 01),Hsp90ab1在鳃、皮肤和肌肉中的表达显著或极显著升高(P<0. 05或P<0. 01);不同低氧浓度胁迫下斑马鱼鳃中HSP47和HSP90ab1蛋白表达均呈现显著增加(P<0. 05)。研究表明,HSP47和HSP90ab1可能是斑马鱼低氧应激中最重要的热休克蛋白成员,具有重要的适应功能。

蛋白S的基因多态性与肺血栓栓塞症

一、蛋白S的结构和功能 蛋白S（PS）是一种相对分子质量为71000的维生素k（Vitk）依赖性蛋白，1977年DiScipio等人在人血浆中首次发现，它主要由肝实质细胞、内皮细胞、巨核细胞、人睾丸间质细胞及脑细胞合成。在血液中以两种形式存在：60％的蛋白S以非共价键与补体C4结合餐白（CABP）结合成复合物，40％的蛋白S以游离（F蛋白s）形式存在，具有APC辅因子的活性。成熟蛋白S是由635个氨基酸（aa）组成的单链糖蛋白，分子中含有3个糖基化位点（Asn458，

百令胶囊中醇溶性蛋白质类成分的提取分离、相对分子质量确定及生物活性筛选

目的:提取分离百令胶囊中的醇溶性蛋白质类成分,并进行相对分子质量确定和初步生物活性筛选。方法:采用水提醇沉法提取蛋白质类成分,HPGFC分离,再用Tricine-SDS-PAGE电泳法测定相对分子质量,最后用表达谱基因芯片技术初步筛选醇溶性蛋白质类成分的生物活性。结果:提取分离得到百令胶囊中2段醇溶性的蛋白质类组分,其中蛋白质类组分Ⅰ包含2种不同的蛋白,相对分子质量约为3.4×104与2.2×104;蛋白质类组分Ⅱ中包含3种不同的蛋白,其相对分子质量约为3.2×104,3×104,2.5×104。表达谱基因芯片显示该2段醇溶性蛋白质类成分引起肾293细胞基因表达的不同。结论:所分离得到的醇溶性蛋白质类成分对肾293细胞的基因表达有影响。

丹参酮ⅡA抗乳腺癌T47D细胞增殖的GPER途径研究

目的利用经典雌激素受体（estrogenic receptor,ER）和G蛋白偶联雌激素受体（G protein-coupled estrogen recep-tor,GPER）阳性乳腺癌T47D细胞,探索丹参酮IIA（TanshinoneIIA）对细胞增殖活性的影响及其GPER介导与调节功能.方法以GPER激动剂G1和GPER拮抗剂G15为工具药干预,并应用GPERSiRNA转染构建GPER基因沉默的T47D细胞,利用MTT细胞增殖实验观察丹参酮IIA对T47D细胞增殖速率的影响及GPER的介导作用.利用Westernblot方法检测丹参酮IIA对T47D细胞GPER表达情况的影响.结果1×10^-5 mol·L^-1 ～1×10^-7 mol·L^-1丹参酮IIA能够明显抑制T47D细胞增殖,且该抑制作用可被G1拮抗,可被G15增强.丹参酮IIA作用于GPER基因沉默的T47D细胞,该细胞表现出更为明显的生长抑制效应.West-ernblot测定结果表明,1×10^-5 mol·L^-1和1×10^-6 mol·L^-1丹参酮IIA可使T47D细胞GPER蛋白表达明显降低.结论丹参酮IIA具有抑制乳腺癌T47D细胞增殖的作用,该抑制作用可经GPER途径介导;且丹参酮IIA具有对靶细胞GPER表达的调节功能.

狂犬病病毒糖蛋白功能的研究进展

狂犬病是一种危害极大的人兽共患病。该病流行于世界80多个国家和地区,近年来发病率有所升高,严重威胁人畜健康。狂犬病病毒（RV）属弹状病毒科狂犬病病毒属。狂犬病病毒基因组是由11 928个或11 932个核苷酸组成的单股负链不分节段的RNA,相对分子质量约4.6×106。基因组从3＇端至5＇端的排列依次为核蛋白基因（N）、磷酸化蛋白基因（NS）、基质蛋白基因（M）、糖蛋白基因（G）、RNA依赖多聚酶（L）5个结构基因,