相对定量Real-time PCR分析不同品种鸡胚H-FABP基因表达的差异

选用孵化5d的9只莱芜黑鸡,9只汶上芦花鸡和8只济宁百日鸡胚以及孵化11d的12只莱芜黑鸡,11只汶上芦花鸡和9只济宁百日鸡胚作为研究对象,采用相对定量Real-timePCR的方法,研究心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因在不同品种鸡胚中表达的差异。结果显示检测的3个品种孵化11d的鸡胚中H-FABP基因的表达高于孵化5d的鸡胚。其中莱芜黑鸡的H-FABP基因的表达量变化最小,孵化11d的表达量约为孵化5d的2.64倍;变化最大的是济宁百日鸡,孵化11d的表达量约为孵化5d的4.17倍;汶上芦花鸡H-FABP基因在孵化11d的表达量约为孵化5d表达量的2.96倍。

金黄色葡萄球菌基因表达的DNA扣除法Real-time RT PCR相对定量分析

【目的】金黄色葡萄球菌作为一种分布广泛的致病微生物和研究革兰氏阳性菌遗传背景的模式菌株,利用real-time RT PCR对相关毒素及调控基因进行表达定量分析,在生物、医学、食品检测等领域具有较大研究价值。【方法】对制备好的反转录(RT,含有cDNA和DNA)和非反转录(RT—,仅含DNA)样品进行Real-time PCR检测,根据经典(1+E)—△△Ct相对定量算法并结合PCR效率公式建立一种基因表达相对定量分析的DNA扣除法,将得到的Ct值转换为各样品含量,从RT样品中扣除RT—样品的量,无需DNaseⅠ酶解处理就可以去除DNA的影响,RT—样品的检测结果还可同时作为稳定的DNA内参。【结果】采用以上方法分析金黄色葡萄球菌肠毒素A基因(sea)、16S rRNA和RNAⅢ的表达情况,在含有葡萄糖的NB培养基中sea的相对转录水平随着葡萄糖浓度的增大而升高,RNAⅢ的相对转录水平随葡萄糖浓度的变化而产生小幅度的波动,16S rRNA在菌体生长初期时的表达量较为稳定;与绝对定量法比较,结果差异较小(均小于15%),且差异不显著(p>0.05)。【结论】这种基于DNA扣除法的Real-time RT PCR相对定量方法可以有效的对金黄色葡萄球菌的基因表达进行分析。

Real-Time PCR探针法定量检测沙门菌方法的建立及应用

目的建立快速、特异性好、灵敏度高的Real-Time PCR方法定量检测沙门菌。方法根据编码沙门菌肠毒素基因stn的核苷酸序列,设计荧光探针和一对引物,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立定量检测沙门菌的方法。结果建立的Real-Ti me PCR方法有很好的特异性与敏感性,所检测沙门菌结果均为阳性,而非沙门菌均为阴性;标准曲线相关系数为R2=0.993,其敏感性为5CFU。运用该方法对108份鸡粪便、50份鸡肉以及58份水样进行检测,阳性率分别为3.7%(6/108)、4%(2/50)和3.4%(2/58),与传统细菌分离检测结果相符。结论结果表明该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点,此研究为环境及疾病诊断中沙门菌快速检测提供了新方法。

猪链球菌2型的Real-time PCR定量检测研究

目的 建立了基于TaqMan探针的Real-time PCR方法，实时、定量检测猪链球菌2型。针对GenBank公布的猪链球菌2型的csp2J基因序列设计一对引物和TaqMan探针，建立了Real-time PCR检测方法，制作标准曲线，定量检测猪链球菌2型。通过对6种细菌（9株菌株）的DNA进行扩增。结果所有4株猪链球菌2型均可产生扩增曲线，其他5株非猪链球菌2型均不产生扩增曲线。细菌纯培养物的检测敏感度为6～8CFU／PCR反应体系，相关系数均为0．99（r^2=0．99），整个试验可在1．5h内完成。建立的方法可用于猪链球菌2型的快速、定量检测。

用基于TaqMan探针的Real-time PCR技术定量检测副溶血弧菌

副溶血弧菌是一种引起食源性疾病的重要病原菌,传统的鉴定方法费时费力且容易出现假阴性,建立一种定量检测副溶血弧菌基因的方法尤为重要。根据GenBank公布的副溶血弧菌的gyrB基因序列设计一对引物和TaqMan探针,建立了基于TaqMan探针的RealtimePCR方法。通过对9种细菌(12株菌株)的DNA进行扩增,结果所有4株副溶血弧菌均可产生扩增曲线,其他8株非副溶血弧菌均不产生扩增曲线,证明了引物和探针具有很高的特异性。细菌纯培养物品和人工布菌的检测敏感度分别为1CFUPCR反应体系和10CFUPCR反应体系,相关系数均为0.99(r2=0.99),整个试验可在1h内完成。建立的方法可用于海产品中副溶血弧菌的快速定量检测。

肉中猪源性成分Real-time PCR定量检测技术

【目的】建立一种快速、准确的肉中猪源性成分定量检测方法。【方法】首先从GenBank数据库中筛选猪特异性的微卫星DNA,根据微卫星DNA核酸序列设计引物,对常见10种动物基因组DNA进行PCR扩增,通过有无扩增产物判断筛选的微卫星DNA对猪源性成分的特异性。然后根据微卫星DNA核酸序列,设计特异性引物和探针,建立猪源性成分Real-time PCR检测方法,采用双标准曲线分别对猪源性成分和总动物源性成分进行定量,计算猪源性成分的百分含量。【结果】筛选到猪特异性微卫星DNA(Accession EF172428),根据其序列设计的引物SEQ-sus2-F/R只能从猪基因组DNA中扩增出目的条带,其他动物的基因组均无目的条带扩增。建立的Real-time PCR检测方法灵敏度为0.02 ng/25μL反应体系。该方法能够准确检测出混合DNA样品中猪源性成分和混合肉样品中猪源性成分,百分误差分别约为1.32%和1.06%-7.12%。【结论】本研究利用Real-time PCR技术建立的定量猪源性成分的检测方法可以用来检测猪源性成分在混合样品中的百分含量。

Real-time定量PCR检测人类布鲁氏菌应用价值

目的:Real-time定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测感染布鲁氏菌病的患者,在应用抗生素治疗前、后布鲁氏菌表面蛋白是否有变化,为进一步研究布鲁氏菌药物研发提供科学依据。方法:采用自身病例对照的方法,对比布鲁氏菌感染者在应用抗生素治疗前、后布鲁氏菌表面蛋白的变化。结果:Real-time定量PCR方法能够检测出应用抗生素治疗前、后全血中布鲁氏菌表面蛋白的变化。结论:采用Real-time定量PCR检测方法可有效地检测出布鲁氏菌的表面蛋白。

鸡Ⅱ型星状病毒绝对定量real-time PCR的建立及应用

研究旨在建立一种检测鸡Ⅱ型星状病毒(CAstV)绝对定量的检测方法。采用PCR方法扩增Ⅱ型CAstV保守区域基因RdRp部分基因,将其克隆至pGEM-T载体作为阳性标准质粒,并根据获得的RdRp基因设计合成一对133 bp引物,成功建立了Ⅱ型CAstV的绝对定量real-time PCR的检测方法。结果显示:研究构建的检测方法线性关系良好,检测灵敏度为10copies/μL,且对常见的禽源病毒均无非特异性扩增,特异性好。应用建立的绝对定量real-time PCR检测了病毒感染1日龄雏鸡不同组织样品,掌握了鸡Ⅱ型星状病毒在鸡体内不同组织内的分布及增殖情况。试验成功建立了Ⅱ型CAstV绝对定量real-time PCR检测方法,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为进一步深入研究Ⅱ型CAstV的生物学特性提供了检测手段。

一种新颖简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法的建立

为建立一种新颖、简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法,根据实时定量标准曲线,推导出相对定量基因表达的公式.公式显示相对表达指数只与CT值和标准曲线的斜率相关.构建标准曲线的标准品需要通过克隆和体外转录获得,实验过程繁琐.当人为成比例增减标准品各个稀释度的具体拷贝数时,标准曲线的斜率并不改变,说明标准曲线斜率与标准品的具体拷贝数无关.因此,新的相对定量方法可以用任何一个待测样品的总RNA(或cDNA),经系列稀释后作为标准品,来构建相对定量标准曲线,获得斜率.与绝对定量法比较,新方法获得了基本相同的斜率和非常一致的定量结果(差异小于4%),而传统的2-#$CT法却表现出较大的定量误差.这些结果表明,新的相对定量方法是一种简便、准确和高效的定量基因表达的方法.

运用Real-time PCR方法研究日粮添加豆油与胡麻油对肉牛瘤胃纤维分解菌数量的影响

本研究分别以产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminobacter albus)和溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)16S rDNA序列设计引物,运用Real-ti me PCR技术研究日粮中添加豆油与胡麻油对肉牛上述4种瘤胃纤维分解菌数量的影响。结果表明,与对照组(CK)相比,添加豆油组(LOC1)和胡麻油(LOC2)组,产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminobacter albus)和溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisol-vens)数量显著减少(P<0.05),分别降低了78%和31%、30%和36%、27%和23%、6%和13%。通过该方法的结果表明日粮中添加4%的豆油和胡麻油显著减少了瘤胃中纤维分解菌,对产琥珀酸丝状杆菌的影响明显。而且采用Real-ti me PCR方法对瘤胃纤维分解菌进行定量,可以快速有效反映出在日粮改变的情况下菌的数量变化趋势,相对于传统计数方法更直观、快捷与准确。

利用不同实时定量PCR方法分析相对基因表达差异

利用实时荧光定量PCR方法分析目标基因转录本之间的表达差异,目前常用的分析实验数据的有绝对定量和相对定量方法。为了克服绝对定量方法的繁琐和简化相对定量的分析方法,分别利用2-ΔΔCt、2-ΔCt和标准曲线法对水稻OsRDB1基因在不同化学试剂和激素处理下的表达差异进行了分析,发现2-ΔΔCt必须引入标准的看家基因作为参考,计算方法繁琐,计算结果受扩增效率影响;而利用2-ΔCt和标准曲线法计算方便,节省定量PCR试剂,但其结果易受到RNA浓度测量准确率的影响,其中标准曲线法引入斜率消除扩增效率的影响,最能测得实际的原始拷贝数差异。

实时RT-PCR基因表达相对定量REST~软件分析与2^((-ΔΔCT))法比较

目的利用实时RT-PCR技术建立一种简便、准确的基因表达相对定量方法。方法以正常的人支气管上皮细胞株(16HBE)cDNA为模板5倍系列稀释,分别作DNA聚合酶K(POLK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因标准曲线。以不同剂量反式二羟环氧笨并芘(anti-BPDE)诱导的16HBE、anti-BPDE转化的16HBE及肺癌细胞株(H1299)cDNA为模板,进行实时定量RT-PCR。以GAPDH基因作为内参照,进行POLK基因表达相对定量。实验数据分别采用2(-ΔΔCT)法及REST软件分析。结果5倍系列稀释法制作的标准曲线,呈现较好的线型关系(Rsq0.997)。POLK及GAPDH基因扩增效率分别为117.5%和103.5%。采用2(-ΔΔCT)法计算出的表达比值均比REST软件分析高。结论实时RT-PCR技术结合REST软件分析是一种简便、准确的基因表达相对定量分析手段。

多重实时荧光PCR相对定量法快速诊断唐氏综合征

为了建立一种基于多重实时荧光相对定量PCR技术并应用之于唐氏综合征分子诊断,选择21号染色体上唐氏综合征特异区域基因片段(DSCR3)为目的基因,以12号染色体上的磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)为参照基因,设计合成两对引物以及分别以不同荧光标记的TaqMan探针,在同一个反应管中进行扩增。以相对定量指标△CT值区分唐氏综合征患者与正常人。采用EB病毒转化技术,把唐氏综合征患者外周血B淋巴细胞转化成永生淋巴母细胞系作为标准品。通过优化反应条件,使得目的基因和参照基因的扩增效率基本一致,接近100%,模板浓度在3～300ng/μL范围内,△CT值的变异系数小于15%,浓度在30ng/μL时,变异系数最小(<10%),以该浓度的DNA作为模板进行批内和批间实验的△CT值重复性好,变异系数分别为9.8%和13.3%。运用建立的方法检测20例唐氏综合征患者的血标本和30例正常人的血标本,正常人△CT值范围是-1.90～-1.30,患者的△CT值范围是-2.95～-2.15,两组之间无交叉重叠,有明显差异(P<0.001)。唐氏综合征患者永生细胞系建系成功,染色体核型和DNA分析表明建系前后遗传是稳定的。因此,实时荧光定量PCR比较△CT值的相对定量法快速诊断唐氏综合征是可行的。

猪流行性腹泻病毒Real-timePCR检测方法的建立

为定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)载量,建立PEDV的Real-time PCR方法。用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段,构建含有M基因片段的重组质粒,用该重组质粒进行SYBR Green I Real-time PCR,来建立检测PEDV的荧光定量PCR方法。结果显示:在(5.56×102～5.56×107)拷贝/μL范围内,所建立方法具有优良的线性关系,其决定系数为0.9996,扩增效率为99.5%,扩增产物的熔解曲线只有一个特异性峰,无引物二聚体峰,熔解温度为(81.18±0.21)℃。该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒II型等猪源病毒均检测不到扩增产物,重复性试验的变异系数小于3%,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明:建立的Real-time PCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏性高,可用于PEDV的定量检测及其早期感染的快速诊断。

双标准曲线相对定量PCR试验原理与方法

实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是一种准确有效的核酸定量分析技术,具有易操作、高通量、高敏感性、高特异性、高度自动化和低污染等优点,并随新定量PCR仪及新操作方法的发展而得到广泛应用,但是,定量PCR的高敏感性特点使得实验操作严格而繁琐。阐述了一种改进的相对定量方法——双标准曲线法的试验原理和特点,描述了定量PCR体系的优化方式,探讨了试验误差分析方法及试验操作技巧,并就试验数据的处理方法进行讨论。试验证明,双标准曲线法是一种经济、简单而准确的定量方法。

合肥市能见度与相对湿度、PM_(2.5)质量浓度的定量关系

为了研究合肥市能见度影响规律,为改善城市大气能见度提供科学依据,利用合肥市2013年1月—2015年12月的气象观测数据和颗粒物质量浓度数据,采用统计分析方法研究了合肥市大气能见度与相对湿度和PM_(2.5)质量浓度的定量关系,以及不同等级能见度下相对湿度和PM_(2.5)浓度的统计特征。结果表明,PM_(2.5)质量浓度与相对湿度共同影响合肥市大气能见度变化,较低相对湿度下(RH<60%),能见度降低主要受PM_(2.5)质量浓度升高的影响;较高湿度条件下(RH≥60%),能见度降低主要是由于相对湿度增加造成的大气粒子吸湿增长导致消光性能增大,且这种作用在污染程度较轻时更加突出。RH≥60%时,相对湿度每增加1%,平均能见度降低0.172 km;当RH≥90%时,平均能见度基本在5 km以下。PM_(2.5)质量浓度与能见度呈幂函数关系,40%≤RH<60%时,PM_(2.5)的影响作用最显著;PM_(2.5)质量浓度对能见度的影响阈值随相对湿度增加而减小,当PM_(2.5)质量浓度低于46μg?m^(-3)时,能见度随着PM_(2.5)质量浓度降低而迅速增大。随着相对湿度增加,或者PM_(2.5)质量浓度增加,低能见度出现频率呈上升趋势;高湿度、高细颗粒物浓度均可导致低能见度的出现。当前一日能见度低于7km,当日相对湿度大于75%,且PM_(2.5)质量浓度大于65μg?m^(-3),当日能见度超过75%的比例在5 km以下。当前一日PM_(2.5)质量浓度达到中度及以上污染,当日能见度随着相对湿度增加逐渐减小,RH≥80%时,能见度低于5 km的比例达到70%。

基于成岩储集相定量分类模式确定特低渗透相对优质储层——以AS油田长6_1特低渗透储层成岩储集相定量评价为例

针对陕北斜坡中部特低渗透储层受沉积环境、成岩作用及构造等因素影响,成岩过程压实和胶结作用强烈,储层储集性能和渗流结构差异大的特点。利用AS油田长61特低渗透储层成岩储集相定量分类模式圈定相对优质储层,分别进行了区块长61砂岩的成岩作用和孔隙演化分析,建立了不同类别成岩储集相定量分类模式与综合评价指标体系。不同类型成岩储集相成岩过程参数演化及其储集、渗流特征明显不同。Ⅰ、Ⅱ类成岩储集相压实孔隙损失率30.0%～38.1%;胶结孔隙损失率30.1%～36.0%;溶蚀次生孔隙度增加达9.7%,平均溶蚀增加孔隙度都在5.1%～6.5%。它们在低孔、特低渗储层成岩过程中压实、胶结损失孔隙相对较少,溶蚀增加孔隙较多,成为定量评价该区长61特低渗透相对优质储层的成岩储集相"甜点"标准。选用区块各井长61样品物性分析及储集空间鉴定结果,沿成岩过程进行孔隙演化分析推演,得出区块长61各类井成岩阶段孔隙演化参数。分别利用压实损失孔隙度、胶结损失孔隙度、溶蚀增加孔隙度、孔隙度、渗透率及面孔率等特征性参数,通过灰色理论集成,进行被评价参数与评价指标的矩阵分析、标准化、标准指标绝对差的极值加权组合放大及综合归一分析处理,综合成岩过程中参数演化定量分析的多种信息,筛选出Ⅰ、Ⅱ类成岩储集相"甜点"。它们主要分布在酸源的湖盆中心下伏烃源岩(生油区)附近,处于三角洲前缘多期水下分流河道叠置部位的有利储集砂体中,成岩过程中压实、胶结损失孔隙度较小,在其有机酸性水形成时期保留了较多原生孔隙,酸性水容易进入并溶解其中易溶的碎屑颗粒及胶结物,次生浊沸石和长石溶蚀孔隙发育,形成了该区长61特低渗透储层中含油有利区的相对优质储层。通过上述筛选的优质储层确定出该区湖盆中心向南西方向含油有利区连片的规模和范围,圈定出该区沉积作用、成岩作用、后期构造作用及流体改造作用形成的有利成岩储集成因单元,有效地反映出该区特低渗储层中相对优质储层形成的地质特点,进一步表征了该区特低渗透储层含油有利区的分布规律、延伸方向及非均质性特征。从而,提高了该区储层沉积、成岩特征及其含油有利区分布的认识,为特低渗透油田增储上产提供了有利目标和井区。

荧光定量PCR检测干旱胁迫下长春花Crlea基因的相对表达(英文)

首次从长春花中克隆了Crlea（Crlea for Catharanthus roseus late embryogenesis abundant）的全长基因,采用荧光定量PCR方法对干旱胁迫下长春花叶片和根部Crlea基因的表达模式进行监测,结果表明,在0.5～8h的胁迫时间中,叶片和根部的Crlea基因表现出相似的积累模式.长春花Crlea基因的表达随着胁迫时间的延长而表达增强.在叶片中,在6 h和8 h的干旱处理后,Crlea基因表达显著提高,分别是未处理材料的9.984和20.431倍.在根部, 在8 h的处理后,Crlea基因的表达量显著提高（2.831倍于对照）.初步结果表明Crlea基因的表达没有组织特异性,并且为干旱胁迫正调控.

鸡传染性支气管炎病毒Real-time RT-PCR检测方法的建立及应用

为定量检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)载量,建立IBV的Real-timeRT-PCR方法。用RT-PCR方法扩增出IBV的N基因片段,并克隆到pEASY-T3载体中,构建成含有N基因片段的重组质粒。应用该重组质粒进行SYBRGreenⅠReal-timePCR,建立了定量检测IBV核酸的标准曲线与直线回归方程,该方法显示:特异性强,检测下限至少达到5.58×102拷贝/μL,其重复性试验的变异系数小于3.2%;用建立的方法对实验接种IBVM41株的雏鸡组织中的病毒核酸进行了定量检测,检测结果显示:攻毒后肾脏中IBV含量高于支气管和肺脏,支气管和肺脏中病毒含量在攻毒后第3天高于攻毒后第7、10天,并证实临床表现与病毒载量之间存在密切关系。研究结果表明,建立的Real-timeRT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于IBV的定量检测。