相对荧光定量法检测人体2',5'-寡聚腺苷酸合成酶相对表达水平

目的:建立相对荧光实时定量法(RT-QPCR 2_(-ΔΔCt)),考察聚乙二醇化重组人干扰素α2b注射液临床Ⅰ期试验中给药后外周全血中2',5'-寡聚腺苷酸合成酶(2',5'-OAS)相对药前点的相对表达水平变化。方法:根据Gen Bank中查询的2',5'-OAS的序列构建质粒,并纯化定量作为方法标准品,制作标准曲线及验证样品,考察该方法的准确度及精密度;采用RT-QPCR 2_(-ΔΔCt)方法,以个体药前样品为对照,GAPDH为内参,比较考察给予聚乙二醇化重组人干扰素α2b注射液(受试品160μg/人)与阳性对照药派罗欣(180μg/人)后外周血中2',5'-OAS mRNA表达变化倍数;同时,基于ELISA方法对2',5'-OAS蛋白浓度表达进行分析。结果:2',5'-OAS标准曲线有相对较好的线性(R2=0.99),cDNA 2',5'-OAS与2',5'-OAS标准品的PCR产物熔解曲线温度一致,说明引物特异性好。2个剂量组中m RNA表达水平均在20 h左右达到峰值,其中160μg剂量组中峰浓度较高。ELISA检测血清中2',5'-OAS浓度无明显变化。结论:与传统蛋白水平检测的ELISA方法相比,RT-QPCR 2_(-ΔΔCt)灵敏度较高,可以作为一种检测外周全血中生物标志物的替代方法,以给予药效学研究的临床支持。

H5N1禽流感病毒感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立H5N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法,并检测H5N1 AIV感染前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平。方法提取豚鼠肺脏组织RNA,反转录合成cDNA,将cDNA模板按10倍系列稀释为9个浓度(1.00 E+10~1.00 E+02 copies/μl),进行PCR扩增。以β-actin为内参,建立标准曲线,比较两基因的扩增效率,验证该方法的引物特异性、重复性及灵敏度。同时用该方法检测H5N1 AIV攻毒前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平。结果 c DNA模板最佳稀释度范围为1.00 E+09~1.00 E+04。豚鼠MAVS和β-actin基因的标准曲线斜率差值<0.1,R^2=0.999,扩增效率分别为100.2%和100.3%;两基因扩增溶解曲线峰单一,可扩增出清晰的目的条带,且无非特异性扩增;两基因Ct值的变异系数(CV)均<10%;灵敏度为1.00 E+03 copies/μl。感染H5N1 AIV的豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平下调。结论成功建立了H5N1 AIV感染豚鼠体内MAVS的SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法,并发现H5N1 AIV感染可导致豚鼠体内MAVS表达水平下调。

荧光定量RT-PCR对猪流行性腹泻病毒在仔猪体内分布规律的研究

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)在感染仔猪各主要器官中的增殖和分布情况,本研究根据PEDV N基因和宿主细胞GAPDH基因建立荧光定量RT-PCR法,并以该方法检测各个发病期的哺乳仔猪各器官内PEDV的病毒载量。结果表明,仔猪感染PEDV后,在49 h^72 h出现典型的猪流行性腹泻症状,肠、肠系膜淋巴结、肺等器官出现严重病变。利用本研究建立的检测方法在仔猪体内肠、肠系膜淋巴结、肺、脾、肾、心、肝这些器官中均可以检测到PEDV;其中肠、肠系膜淋巴结、肺中病毒载量最高,而且感染时间早、持续时间长。研究表明,PEDV的感染呈持续性、多脏器性,并对肠和肺有组织嗜性;结合本实验室前期的病理研究,推测其在消化器官、呼吸器官中增殖能够导致功能细胞的损伤,在免疫器官的增殖能够造成免疫抑制和混合感染。本研究为PEDV的感染特性、定植规律和致病机理的研究及分子生物学检测方法的建立奠定了基础。

重瓣山茶花‘金盘荔枝’C功能基因CjAGL6的全长克隆与表达分析

MADS-box基因家族在调控植物的花器官发育中发挥了重要作用。为研究AG类基因对于山茶花重瓣花形成的作用,采用同源克隆的方法,从山茶花重瓣花品种‘金盘荔枝’(Camellia japonica‘Jinpanlizhi’)的发育早期花芽中分离到了888 bp的山茶花AG基因完整全长序列,命名为CjAGL6,GenBank登录号JX657333。其中开放阅读框长度为747 bp,5'非编码区长37 bp,3'非编码区长141bp。氨基酸序列分析显示,CjAGL6基因编码的蛋白质含有248个氨基酸,与猕猴桃(Actinidia chinensis)、黑柿(Diospyros digyna)等植物的蛋白同源性都在76%以上。同时,CjAGL6基因编码的蛋白含有重瓣花特有的保守区起始氨基酸序列及显著差异的单个氨基酸。相对荧光定量PCR结果表明,该基因在‘金盘荔枝’花芽不同发育时期的表达量为:花芽发育后期>花芽发育中期>花芽发育早期>现蕾期,表达总体趋势为先渐次升高而后急剧降至最低;不同花器官中CjAGL6基因在花柱中的表达量最高,其次为瓣化雄蕊、雄蕊上部和子房,在萼片和瓣化萼片中的表达量最低,总的趋势是在内轮花器官表达量高,在外轮花器官中的表达量低。重瓣花形成是多基因协同作用的结果,CjAGL6基因可能在调控山茶花重瓣花形成中发挥一定的功能。

重瓣山茶花器官发育相关基因CjAPL1的全长克隆与表达分析

为研究A功能基因在山茶花重瓣形成过程中所发挥的功能,利用同源克隆和RACE扩增方法,从重瓣山茶花品种‘金盘荔枝’发育早期的花芽中获得了山茶花AP基因全长cDNA,命名为CjAPL1,GenBank登录号JX657332。该基因全长1 149 bp,其中,开放阅读框(ORF)长度为741 bp,5’非编码区长度206 bp,3’非编码区长度202 bp。经氨基酸序列分析表明:CjAPL1基因编码一条含有246个氨基酸的蛋白质,与猕猴桃、八仙花等植物的Ap1蛋白同源性均在75%以上。Rea-time PCR结果显示,CjAPL1基因在‘金盘荔枝’不同发育时期花芽中的表达量为:花芽发育早III期>花芽发育早II期>花芽发育早I期>现蕾期,表达趋势表现为先逐渐升高而后急剧降低;花器官不同部位中的表达量为花柱最高,其次为子房和萼片,在雄蕊下部和外轮花上部中的表达量最低。这些差异表明,CjAPL1基因可能在‘金盘荔枝’重瓣花形成中发挥作用。

越橘查耳酮合酶基因的克隆及表达分析

为研究越橘花色素苷合成的分子机制,利用RT-PCR和RACE技术从越橘(Vaccinium spp.)果实中克隆了查耳酮合酶基因(CHS)的全长cDNA,命名为VcCHS,GenBank登录号为JN654702。VcCHS全长1 438 bp,包含107 bp的5'非编码区、71 bp的3'非编码区和1个长度为1 260 bp编码419个氨基酸的开放阅读框。该基因编码的蛋白具有CHS家族普遍存在的功能活性位点:Cys(C)164、His(H)303、Asn(N)336和特征多肽序列(RLM-MYQQGCFAGGTVLR)。多重比对分析发现越橘VcCHS基因编码的氨基酸序列与葡萄(Vitis vinifera)CHS基因编码的氨基酸序列相似性达90.2%。系统进化分析表明,该序列与杜鹃花目的植物聚为一类。VcCHS基因在果实发育的整个过程均有不同程度的转录表达,花期和果实成熟期表达量较高,绿果期表达量最低。VcCHS相对表达量变化与花色素苷相对含量的变化趋势具有一致性,并均在果皮组织中达到最高。

ORFV感染羔羊后的组织定位及其病毒载量分析

【目的】研究山羊传染性脓疱病毒的组织定位及病毒载量情况。【方法】选取健康断奶羔羊,通过口唇部和尾根部划线的方法接种山羊传染性脓疱病毒液,正常饲喂,观察记录其发病情况,待出现典型临床症状时,放血处死,采集不同组织,进行羊传染性脓疱常规PCR检测,并对阳性组织进行免疫组织化学分析;同时,利用F1L基因片段与GAPDH内参基因建立相对荧光定量PCR检测方法,测定分析阳性组织的病毒载量;制备病毒载量较高的组织病毒悬液,分析其在OFTu中的增殖情况。【结果】断奶羔羊在攻毒后10 d出现典型疱疹症状;唇部、上颚、鼻甲骨、颈前淋巴结、肠系膜淋巴结和尾根部组织经过PCR鉴定后,均扩增出大小为1023 bp的目的条带;病毒载量结果表明,山羊传染性脓疱病毒在鼻甲骨中的含量最高,其更易在鼻甲骨细胞中增殖。【结论】首次明确了山羊传染性脓疱病毒可在在患病羔羊的多个组织中定殖,且其在鼻甲骨中含量最高,为山羊传染性脓疱疫苗候选毒株的分离纯化及其致病机制的深入研究提供数据支撑。

CMAH基因在小鼠不同组织中的转录水平分析

目的哺乳动物细胞中所含唾液酸及其衍生物主要包括N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)和脱氨神经氨酸(deaminoneuraminic acid,KDN),其中Neu5Ac可在胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH)的催化下合成Neu5Gc。本研究应用相对荧光定量PCR方法检测BALB/c小鼠不同组织中CMAH基因的转录水平,为进一步分析不同组织中所含Neu5Gc含量差异提供参考依据。方法在NCBI数据库中查找CMAH基因mRNA序列并设计特异引物,选择小鼠β-actin为内参基因,应用相对荧光定量PCR方法检测正常BALB/c小鼠9种组织中CMAH基因mRNA的转录情况。结果在9种不同的小鼠组织中,肝脏组织中CMAH基因mRNA转录水平最高,其分别为脾脏的2.46倍、肾脏的3.17倍、气管的5.14倍、肺脏的11.70倍、心肌的21.12倍、骨骼肌的31.37倍、小肠的66.90倍以及脑组织的1055.99倍。结论本研究确定BALB/c小鼠CMAH基因在多种组织中均有转录且差异较大。

基于转录组测序的铝胁迫下甘蓝型油菜新内参基因的发掘与引物开发

为了研究甘蓝型油菜在铝胁迫条件下内参基因的稳定性,在受到主要铝毒害的根组织内发掘新内参基因,以甘蓝型油菜耐铝品种赣油杂7号和铝敏感品种蓉油18的苗期根组织为研究材料,对营养液培养的试验材料分别设置对照组(0 h)和2个时间梯度(3,24 h)的铝胁迫(100μmol/L AlCl_(3),pH值4.5)处理组。首先,采用有参考基因组的转录组测序技术(RNA-seq)及FPKM值差异基因表达分析,筛选出符合持家基因特征的5个候选内参基因(Actin7、ARFA1E、SAP5、UXS3、UBC9)。随后,依次进行实时荧光相对定量PCR分析,扩增曲线和熔解曲线分析,LinRegPCR扩增效率分析,geNorm、NormFinder和BestKeeper基因表达稳定性分析,REST 2009相对表达量分析等分析步骤。结果表明,新设计开发的5对候选内参基因引物特异性高。从转录组测序数据中筛选出的4个候选内参基因(Actin7、ARFA1E、SAP5、UXS3)的表达稳定性获得了验证。按表达稳定性的综合排名由高至低排序依次为UXS3、SAP5、ARFA1E、Actin7,其中最优组合为SAP5和UXS3。综上所述,本研究开发的候选内参基因引物特异性高,可以提高铝胁迫试验体系实时荧光相对定量PCR试验的准确性,新发掘的内参基因(Actin7、ARFA1E、SAP5、UXS3),可以作为铝胁迫试验体系实时荧光相对定量PCR试验的新内参基因。

马A3Z3V1抑制马传染性贫血病毒早晚期反转录的鉴定

马A3Z3V1是宿主细胞内的一种APOBEC3免疫因子,它可以有效抑制马传染性贫血病毒(EIAV)在马宿主细胞内的复制。为鉴定马A3Z3V1分子对EIAV早晚期反转录的抑制作用,本实验根据EIAV的R/U5和gag基因序列分别设计了检测EIAV早晚期反转录产物的引物并建立了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,利用该方法评价免疫因子A3Z3V1对EIAV逆转录过程的影响。结果显示,在早期反转录过程中,A3Z3V1可以使EIAV的反转录产物最高减少7倍;在晚期反转录过程中,A3Z3V1可以使EIAV的反转录产物最高减少3倍。本实验结果将有助于进一步研究APOBEC3分子的抗病毒作用机制。

小干扰RNA(siRNA)对马立克氏病淋巴瘤细胞chTERT基因表达的抑制

为通过体外转录的小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)抑制马立克氏病淋巴瘤细胞(MDCC-MSB1)中鸡端粒酶反转录酶(Chicken telomerase reverse transcriptase,chTERT)mRNA的表达,探讨chTERT在MDCC-MSB1中的作用,本试验设计了针对chTERT mRNA的特异siRNA序列(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3),利用T7 RNA聚合酶体外转录系统,制备21 bp的siRNA分子,通过脂质体介导转染MDCC-MSB1细胞,采用荧光实时相对定量RT-PCR方法检测转染细胞chTERT基因mRNA的相对表达量,流式细胞仪测定转染细胞周期变化情况。结果显示,siRNA-1和siRNA-3组在转染24 h后,有效地抑制了chTERT mRNA的表达,抑制率分别为68%和81%。细胞周期检测结果显示,与对照组相比,siRNA-1和siRNA-3转染组细胞在转染后24 h G0/G1期比例显著上升(P<0.05),S期比例显著下降(P<0.01),从而表明chTERT表达量的降低可有效抑制MDCC-MSB1细胞增殖。siRNA可有效抑制MDCC-MSB1细胞中chTERT基因的表达,而chTERT表达量的降低对MDCC-MSB1细胞增殖具有明显的抑制作用。

4种壳色蛤仔TYR基因的表达特性研究

为了解色素控制基因与壳色的关系,本实验用荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术分析了酪氨酸酶基因(Tyrosinase,TYR)在菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)4种壳色蛤仔和7种组织中的表达特性。结果表明,酪氨酸酶基因在鳃、外套膜、闭壳肌、性腺、内脏团、水管和唇瓣中均有表达,其中外套膜中表达量较高,其次为鳃,在闭壳肌中表达量最少。不同的酪氨酸酶基因在4种壳色的表达量不同,酪氨酸酶基因TYR2、TYR3、TYR6和TYR9在白斑马蛤中表达量居高,且与斑马蛤和白蛤差异显著(P<0.05)。TYR2、TYR6和TYR10在橙蛤中表达量最高,推测与橙色形成有关。TYR11在斑马蛤中表达量最高,且与白蛤和白斑马蛤差异显著(P<0.05),推测与背景色形成有关。系统发育分析结果表明,TYR3与马氏珠母贝(Pinctada martensii)同源性最高为64%。TYR10与加州双斑蛸(Octopus bimaculoides)同源性最高,为53%。与长牡蛎进化关系最近。

牡丹查耳酮合酶基因Ps-CHS1的克隆及其组织特异性表达

以牡丹(Paeonia suffruticosa)品种'彩绘'为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了一个牡丹查耳酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因cDNA全长,命名为Ps-CHS1,GenBank登录号为GQ483511。序列分析结果表明,Ps-CHS1全长1475bp,包含82bp的5′非编码区、208bp的3′非编码区和一个长度为1185bp编码394个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示该基因编码的蛋白具有CHS家族保守存在的所有功能活性位点和特征多肽序列。序列比对和系统进化分析表明,Ps-CHS1与杨柳科、锦葵科、蔷薇科等植物的CHS亲缘关系较近,相似性达90%以上。相对荧光定量PCR分析表明,Ps-CHS1在花瓣中的表达量最高,其次是萼片,再次是叶片和雄蕊,在心皮中表达量最低。

橡胶树白粉菌MAT相关基因(STE2基因)的克隆及表达分析

以橡胶树白粉菌(Oidium heveae B.A.Steinm)为材料,根据同源性克隆得到一个MAT相关基因的DNA和c DNA序列,命名为OH-MAT2。生物信息学分析表明,这个基因DNA全长为964 bp,具有一个921 bp的完整开放阅读框(ORF),编码307个氨基酸。其编码的蛋白质分子量为35 584.1,等电点为9.78,且是稳定的疏水性蛋白质。氨基酸序列分析该蛋白质具有STE2家族的保守结构域。结构预测表明该蛋白质主要有α-螺旋、β-折叠及转角构成。相对荧光定量显示该基因在侵染不同时段有表达,且差异明显。