SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量

目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。

多重实时荧光定量聚合酶链式反应在芝麻酱掺假鉴别中的应用

目的研究基于分子生物学技术,建立多重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测芝麻酱中的植物源性成分,实现芝麻酱的快速掺假鉴别,突破单标准单物种检测的局限性。方法该研究以芝麻2S albumim mRNA基因、花生Ara b2基因、大豆Lectin基因、玉米adh1基因设计特异性引物和探针,优化反应体系,建立多重实时荧光定量PCR技术检测芝麻酱中的芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分,并应用于市售的芝麻酱样本检测分析。结果该方法高效低成本,特异性好,对小米、绿豆等10种非目标源性成分无特异性扩增;对芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分的最低检出限为100 pg/μL,具有较高的灵敏度;应用建立的方法,对市售21份芝麻酱样本进行检测分析,检测结果与标签标注不符合的有4份,标签标注符合率为80.95%,与参比方法检测结果一致。结论建立的多重实时荧光定量PCR技术对加工成品的检测具有较好的适用性,为芝麻酱的掺假鉴别提供了一种新的分子生物学方法。

定量荧光聚合酶链式反应在流产组织染色体畸变分析中的诊断价值

目的评估在以拷贝数变异测序(CNV-seq)为主要遗传学检测手段对流产组织进行染色体畸变分析中辅以定量荧光聚合酶链式反应(QF-PCR)检测的诊断价值。方法采用QF-PCR及CNV-seq技术同时检测2021年9月至2022年11月海口市妇幼保健院收集的110例流产组织样本。此外,QF-PCR技术将额外检测50例健康人群外周血样本进行数据补充。QF-PCR体系为自建体系,在13、18、21、性染色体共选择17个位点并将其分为两组。Panel A组由D13S796、D13S256、D18S386、D18S535、D21S11、D21S1446、DXS6809、HPRT构成;Panel B组由D13S371、D13S634、D18S51、D18S535、D18S819、D21S1409、D21S1412、DYS218、DXS981、AMEL构成。分析QF-PCR在判别13、18、21、性染色体非整倍体时与CNV-seq结论一致性、QF-PCR为CNV-seq进行母源污染鉴定能力,以及QF-PCR进行13、18、21、性染色体非整倍体的分型能力。结果对110例流产组织进行检测,两种方法结论一致例数占比为93.6%。其中QF-PCR避免了5例CNV-seq自身局限性造成的不准确结论,2例为QF-PCR的检测失败。在母源细胞污染鉴定能力上,15个短串联重复序列的观察杂合度、期望杂合度与个体识别能力值范围分别为0.737~0.950、0.593~0.941、0.817~0.975;D13、D18、D21与DX的累积He依次为0.9999、0.9998、0.9998与0.9985,累积个体识别能力大于0.999999999999999999999999999999;自建的QF-PCR方法在分型能力上表现良好,其干扰因素影响较小。结论QF-PCR联合CNV-seq检测可能成为未来孕早期流产组织遗传学分析的主要方法。它不仅能够降低CNV-seq的误诊率、鉴别母体细胞污染。采用自建QF-PCR体系还能够显著降低联合检测成本。

Taq Man探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测低温酸乳中常见的霉菌和酵母

为提高低温酸乳中霉菌和酵母菌检测效率,根据保守基因延伸因子1α(elongation factor 1α,EF-1α)序列分别针对霉菌与酵母菌设计引物与探针,利用实时荧光定量聚合酶链式反应,基于TaqMan探针分别建立霉菌和酵母菌检测方法。以低温酸乳中常见真菌与乳酸菌基因组DNA为扩增模板进行特异性检验,并对方法灵敏度与重复性进行检验,同时构建标准曲线。结果表明:根据EF-1α基因设计的引物与探针特异性良好;所构建的标准曲线相关系数均大于0.99;该方法检测酵母菌的灵敏度为101 CFU/mL,检测霉菌的灵敏度为102 CFU/mL;重复性检验中组内与组间的变异系数均小于2%,表明方法具有良好的可靠性与稳定性,适用于低温酸乳中霉菌与酵母菌的快速检测。

利用可视基因膜芯片技术与实时荧光定量聚合酶链式反应技术分析肉制品中动物源性成分

为调查了解肉制品中动物源性成分,以帮助判别掺假情况,应用可视基因膜芯片检测技术对市售的肉松、香肠、肉卷、预制调理肉、肉干及肉脯等23份样品动物源性成分进行筛查分析,同时,针对筛查结果采用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法进一步确证。结果表明:可视基因膜芯片检测法与实时荧光定量PCR法检测结果一致,提高了未知样品的筛查效率;在本次随机分析的样品中,动物源性成分检测结果与标签标示不一致的情况占比高达21.7%,肉制品掺假虚标情况不容忽视。

荧光定量聚合酶链式反应法检测婴儿尿液人巨细胞病毒DNA对人巨细胞病毒感染的诊断意义

目的探讨荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)方法检测婴儿尿液人巨细胞病毒(HCMV)DNA水平对婴儿HCMV感染的诊断价值。方法采用FQ-PCR检测348例临床疑似HCMV感染婴儿尿液中HCMVDNA水平。同时采用化学发光免疫分析法(CLIA)检测婴儿血清HCMV-IgM抗体。在尿液HCMVDNA检测阳性患儿中比较血清HCMV-IgM抗体检测阳性与阴性患儿尿液中HCMVDNA拷贝数差异。结果FQ-PCR检测尿液HCMVDNA的阳性率为41.74%,CLIA检测婴儿血清HCMV-IgM抗体的阳性率为19.83%。2种方法对HCMV感染诊断的符合率为76.7%。前者诊断阳性率显著高于后者(χ2=69.44P<0.01)。在尿液HCMVDNA检测阳性患儿中,IgM抗体阳性组尿液HCMVDNA拷贝数显著高于阴性组(P<0.01)。结论FQ-PCR检测尿液HCMVDNA是早期诊断婴儿HCMV感染的敏感有效的方法。HCMV感染婴儿尿液中高HCMVDNA拷贝数与活动性HCMV感染密切相关;FQ-PCR方法检测尿液HCMVDNA水平对于判断是否为HCMV活动性感染具有一定意义。

荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应检测大鼠死后肾mRNA

目的探讨荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应(fluorescencesemi-quantitativereversetranscrip-tase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测大鼠死后不同时间肾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA含量变化对死亡时间(postmorteminterval,PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,利用荧光标记半定量RT-PCR技术检测大鼠肾GAPDHmRNA在死后48h内相对表达量的变化情况。结果在死后即刻至40h内大鼠肾均可检测出GAPDHmRNA,且其扩增产物呈规律性下降。结论荧光半定量RT-PCR技术检测大鼠死后肾GAPDHmRNA含量变化对PMI推断具有一定的应用价值。

检测乙酰微小杆菌的双重实时荧光定量聚合酶链式反应方法的建立

以鲜切叶菜中的乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)为研究对象,建立定量检测E.acetylicum的双重实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)方法。以前期试验发掘到的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)的特异性基因P401_RS0117025和E.acetylicum的特异性基因oxi_50582462为检测靶点,对其设计特异性探针,并对反应体系进行优化,以12株E.acetylicum为阳性对照,以4株微小杆菌属内其他种的菌株以及10株非微小杆菌的腐败菌/致病菌作为阴性对照,对建立的RT-PCR进行特异性检测;通过标准曲线的制备、灵敏度、可重复性来评价该方法的有效性。最后,应用该RT-PCR方法对不同贮藏日期鲜切叶菜中的E.acetylicum进行检测。结果表明:本研究设计的探针特异性良好;检测靶点P401_RS0117025与oxi_50582462的标准曲线的R2值分别为0.994和0.999,且重复性好;该方法的DNA检测限为1.629×10^(-7)ng/μL,纯菌菌落检测限为3.4 CFU/m L,并能对鲜切叶菜中的E.acetylicum进行灵敏检测。此外,还建立了"Ct(阈值)-Nt(菌体浓度)"的数量关系,能对供试样品中的E.acetylicum进行绝对定量。总之,本研究建立了准确、灵敏、高效检测食品中腐败菌E.acetylicum的RT-PCR定量方法,为食品货架期预测提供了理论依据。

荧光定量聚合酶链式反应检测恶性疟原虫的研究

目的 评价荧光定量聚合酶链式反应 (FQ- PCR)检测恶性疟原虫的效果。 方法 以不同浓度梯度标准对照作为参照 ,对 12 7份疟区血样进行检测 ,并将所得结果与镜检、常规 PCR法比较。 结果 恶性疟原虫镜检、常规 PCR、FQ- PCR检出的阳性率分别为 33.1%、38.5 %和 40 .9% ;定量检测结果与镜检阳性率呈直线相关 ,相关系数为 0 .96 1。 结论 FQ- PCR检测方法有较高的灵敏度和特异度 。

荧光定量聚合酶链式反应种植前胚胎β-地中海贫血基因诊断

目的 用荧光定量聚合酶链式反应 (PCR)方法进行种植前β-地中海贫血一种中国人常见突变类型 CD4 1/ 4 2 (- TCTT)的基因诊断。 方法 来源于β-地中海贫血病人或携带者的 2 89个淋巴细胞和人体外受精 -胚胎移植志愿者剩余的胚胎分离 137个单细胞用荧光定量 PCR方法进行分析。 结果 用单个淋巴细胞诊断β-地中海贫血扩增效率达 96 % ,准确率达 99%～ 10 0 % ,等位基因丢失 (ADO)率仅 0～ 5 %。单个胚胎细胞扩增效率 86 %。 结论 荧光定量 PCR技术是一种敏感、快速、可靠和准确的技术 ,适合包括β-地中海贫血在内的单基因疾病的种植前诊断。

实时荧光聚合酶链式反应技术在慢性乙型肝炎患者血清标本HBV DNA定量检测中的应用价值

目的探讨实时荧光聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术在慢性乙型肝炎(CHB)患者血清标本HBV DNA定量检测中的应用价值。方法选取2015年4月至2018年6月南阳市第二人民医院收治的109例CHB患者作为研究组,同期81例HBV早期感染者作为对照组。均以FQ-PCR技术检测血清标本HBV DNA水平,同时研究组接受拉米夫定治疗,采用FQ-PCR技术动态监测血清标本HBV DNA变异情况,对比两组入院首次HBV DNA表达水平及研究组治疗前后HBV DNA表达水平和变异率。结果入院首次检测研究组HBV DNA表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。经单因素方差分析,治疗后3、6、9个月HBV DNA表达水平对比,差异有统计学意义(P<0.05);两两对比,治疗后9、6个月HBV DNA表达水平低于治疗后3个月,治疗后3个月低于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后9个月HBV DNA变异率高于治疗后6个月,治疗后6个月高于治疗后3个月、治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。结论实时FQ-PCR技术检测血清标本HBV DNA水平可客观反映HBV感染、复制活性,可为临床诊断、疗效评估提供数据支持。

荧光定量聚合酶链式反应法在常见食源性致病细菌检测中的应用价值

目的探究荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法在常见食源性致病细菌检测中的应用价值。方法将菌株及样品经培养基增菌后,分别采用荧光定量PCR和常规的细菌培养检测致病菌,比较两组检出情况。结果 720个样品,采用细菌培养方法检测出了沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血性弧菌等几种常见致病菌;细菌培养法与荧光定量PCR法对致病菌的阳性检出率分别为11.94%和12.50%,差异无统计学意义(>0.05),在不同种类食品中两种方法的检出率差异无统计学意义(>0.05)。结论荧光定量PCR检测应用于食源性致病菌检测,检测速度快,准确性高。

荧光定量聚合酶链式反应联合检测性病病原微生物

目的:探讨荧光定量PCR联合检测性病病原体的临床价值。方法:用荧光定理PCR(FQ-PCR)方法,对淋球菌(NGH)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)、梅毒螺旋体(TP)4种性病病原微生物进行定量测定,并与定性PCR比较。结果:两种PCR方法对NGH、CT、UU、和TP四种病原体检测的总符合率分别为94.83%、89.02%、95.79%、和95.65%,阳性率差异分别为1.72%、1.22%、2.11%和0,两种方法阳性率差异均无显著性意义(P>0.05)。阳性标本定量平均拷贝数对数分别为6.71±3.36、5.56±2.48、6.83±3.17和4.89±3.52。结论:FQ-PCR操作简便、快速,并能准确定量。对于性传播疾病的诊断、病情的发展和预后监测、疗效评价、指导用药均具有很高临床应用价值。

沙门氏致病菌标准阳性模板的构建及实时荧光定量聚合酶链式反应检测

目的:构建重组质粒作为标准阳性模板,建立食品中沙门氏致病菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法。方法:以致病性沙门氏菌inv A基因上特异性片段为目标,设计并合成引物和Taq Man探针,将目标片段连接到PGM-T载体上构建重组质粒,建立实时荧光定量检测体系,并考察方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性。结果:构建出致病性沙门氏菌特异性基因片段的重组质粒,能够作为实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法的标准阳性模板,标准曲线方程为Y=-3.151 lg X+42.86(R2=0.999),灵敏度80拷贝反应体系,能特异区分沙门氏菌与类型的细菌,同时,批内和批间的变异系数均小于5%,具有良好的重复性。结论:本方法能够实现对食品中致病性沙门氏菌进行定性定量检测。

荧光定量聚合酶链式反应检测生殖道沙眼衣原体的临床应用

目的探讨荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)检测技术在泌尿生殖道沙眼衣原体的应用。方法用FQ-PCR法和抗原检测法对怀疑有沙眼衣原体感染的65例门诊患者分别进行检测。结果两种方法阴性符合率为97.73%,阳性符合率为76.19%(P<0.05),差异有统计学意义。结论FQ-PCR法作为一种核酸定量技术、具有高特异、高敏感的特点,不仅可以准确诊断,而且其定量技术可指导临床用药,值得推广。

荧光定量聚合酶链式反应检测乳及乳制品中结核分枝杆菌方法的建立与评价

建立一种快速检测乳及乳制品中结核分枝杆菌的荧光定量聚合酶链式反应法。根据结核分枝杆菌保守序列设计特异引物,建立结核分枝杆菌的实时荧光定量聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)检测法。对该方法的灵敏度、特异度和重复性进行考察。结果表明:建立的实时荧光定量PCR方法标准曲线线性关系良好,得到标准曲线方程为y=-3.29x+38.60(R2=0.998 0);敏感性高,可达1×102 copies/μL;抗干扰能力强,仅结核分枝杆菌出现特异性扩增曲线;重复性良好,分别用不同质量浓度的标准质粒进行组内和组间平行实验,批内和批间的变异系数均小于1%。因此,实时荧光定量PCR法能准确快速检测乳及乳制品中结核分枝杆菌。

荧光定量聚合酶链式反应和基因芯片分型法行HPV分型检测的比较研究

目的比较荧光定量聚合酶链式反应(简称荧光定量法)与基因芯片分型法(简称基因芯片法)在检测人乳头瘤病毒(HPV)中的灵敏度,分析两者的差异及临床意义。方法以246例女性为研究对象,其中111例行液基细胞学诊断、135例行组织学诊断,采用荧光定量法和基因芯片法检测所有受试者15种高危HPV基因型,并进行比较分析。结果荧光定量法检测HPV的灵敏度为55.28%,基因芯片法灵敏度为55.69%,二者比较,差异无统计学意义(P>0.05);两种方法检测结果有较高的一致性(κ=0.745);HPV阳性率随宫颈病变程度增加而上升。结论荧光定量法和基因芯片法检测HPV具有较高的一致性,两者检测灵敏度都较高,宫颈病变的严重程度与HPV感染呈正相关。

基于单核苷酸多态性位点的多重实时荧光定量聚合酶链式反应法鉴别当雄高山牦牛肉

通过比对5个不同地区牦牛线粒体基因的差异,筛选出用于鉴定当雄高山牦牛的11个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点,将这些SNP位点作为引物3′端,同时引入引物碱基错配理念,设计出8对特异性引物,构建出2个三重和1个二重实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)体系,建立一种基于SNP位点和多重RT-PCR技术鉴别当雄高山牦牛肉的方法。结果表明:该方法特异性较好、简便快捷、结果直观可靠,能够有效鉴别当雄高山牦牛肉;方法中3个RT-PCR反应体系扩增产物对应的熔解温度(melting temperature,Tm)范围分别为反应体系A:73.1~75.2、76.0~77.3、79.0~80.0℃,反应体系B:69.5~72.8、75.0~77.9、78.5~80.0℃,反应体系C:76.1~78.1、79.5~80.7℃;根据3个反应体系中熔解曲线峰的有无以及Tm是否符合取值范围来判定样品是否为当雄高山牦牛肉;市售样品测定结果表明,该方法可用于实际样品中当雄高山牦牛肉的快速鉴别。

酶联免疫吸附测定法和实时荧光定量PCR法对乙型肝炎的诊断价值比较

目的比较酶联免疫吸附测定法和实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法在乙型肝炎诊断中的应用价值。方法选取120例疑似乙型肝炎患者作为本次研究对象,分别进行酶联免疫吸附测定法以及实时荧光定量PCR法检验。以病理检查为金标准,分析酶联免疫吸附测定法和实时荧光定量PCR法的检查结果,对比两种检查方法的诊断效能,包括特异度、灵敏度以及准确度。结果120例疑似患者经病理检查确诊75例为乙型肝炎。酶联免疫吸附测定法检出阳性74例,阴性46例;实时荧光定量PCR法检出阳性75例,阴性45例。实时荧光定量PCR法检测乙型肝炎的特异度、灵敏度以及准确度分别为93.33%、96.00%、95.00%,均明显高于酶联免疫吸附测定法的73.33%、82.67%、79.17%,差异有统计学意义(χ^(2)=6.4800、6.9963、13.3724,P<0.05)。结论采用实时荧光定量PCR法进行乙型肝炎的检测具有较高的准确率,可以为医生诊断和治疗方案的制定及调整提供良好的依据。

人微小病毒B19荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立

目的建立可同时检测各型人微小病毒B19(HPV B19)的荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法。方法运用在线工具MAFFT比对分析3种基因型的HPV B19代表病毒株NS1区域序列,针对保守区序列设计特异性的引物和探针。建立检测HPV B19实时荧光定量PCR方法,并对该方法的敏感性和特异性进行评估。结果1×10^(7)~1×10^(2)拷贝/μL以及20拷贝/μL质粒DNA模板绘制的标准曲线,反应效率E为0.946,R^(2)值为0.9966;本方法的检测下限为10拷贝/μL,定量下限为20拷贝/μL。单纯疱疹病毒(HSV)2型、巨细胞病毒(CMV)、B族链球菌(GBS)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV)的阳性DNA病毒检测结果均为阴性,参考质粒及HPV B19阳性样本正常扩增。结论建立的荧光定量PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性,可运用于HPV B19感染的筛查和诊断。