斑茅两个看家基因片段的克隆及其在基因芯片中的应用

根据已发表的同源基因序列,利用RT-PCR技术分离了斑茅(Erianthus arundinaceus)的GAPDH和APRT两个看家基因片段,用它们作为cDNA芯片阳性参照,以未经聚乙二醇(PEG)胁迫处理的斑茅叶片为对照,和PEG胁迫的4组材料同cDNA芯片进行杂交分析。杂交结果显示,GAPDH杂交的Cy5与Cy3平均信噪比(Signal/Noise,S/N)分别为56.12和60.8,APRT杂交的Cy5与Cy3平均信噪比分别为51.06和47.25,信噪比均很高;同时两个看家基因的杂交都显示出极强的信号,其中GAPDH的杂交信号值大于10000,APRT也在8000以上,杂交结果可靠。分析了PEG胁迫4个时段BADH与两个看家基因的表达,BADH的表达有明显变化,而看家基因表达均较稳定。上述结果表明所克隆的两个看家基因在斑茅中表达量高,且PEG胁迫下表达较为稳定,是基因芯片理想的阳性参照。

用DSC测定小鼠看家基因β-actin的PCR反应体系的比热

本实验用差示扫描量热技术,测量了不同反应循环数的以PCR内参小鼠看家基因β-actin为目的序列的扩增体系在30～94℃温度范围内的比热容。实验发现,在扩增的初期(3～15个循环),反应体系的比热随着循环数的增加,变化不大;在扩增的指数增长期(>20个循环)比热先降低后增加。同一循环,比热随着温度的增加而增加。未经过PCR扩增的反应体系的玻璃化转变温度为-15.29℃。

中枢和外周神经损伤后胞体区看家基因表达的变化

目的:观察并比较几种常用的看家基因,包括β-actin,GAPDH,18s RNA,cyclophilin A 等在中枢和外周神经损伤后胞体分布区神经组织中表达的变化。方法:Wistar 雄性大鼠随机分为右侧坐骨神经夹伤,右侧坐骨神经结扎和胸段脊髓半横断三组。手术后7d,用相对定量 RT-PCR 的方法检测几种看家基因在受损神经元胞体分布区神经组织中的表达水平。结果:GAPDH 和 Cyclophilin A 的表达在不同模型中的变化幅度较小,损伤与对照侧比较差异均无显著性。β-actin 和18sRNA 的表达在不同模型中变化不同,在脊髓损伤和坐骨神经结扎后表达的变化有统计学意义。结论:本研究结果为研究神经系统损伤后相关基因表达变化时内参照基因的选择提供参考,同时也为进一步认识看家基因更加广泛的功能提供依据。

链霉菌看家基因引物的设计与验证

看家基因的扩增与测序是进行多基因系统进化分析首先需要解决的问题。针对链霉菌这一群高(G+C)mol%革兰氏阳性细菌,选定4个看家基因:atpD、recA、rpoB和trpB,利用NCBI数据库中已有的2个链霉菌和3个分枝杆菌的全基因组序列,以及另两个链霉菌的recA基因序列,通过软件分析设计了各基因的扩增和测序引物,并优化了扩增反应条件。从所试验的55株链霉菌中,均特异地扩增出了上述4个基因的片段,并成功进行了序列测定,验证了所设计引物的实用性。所归纳的引物设计方法可用于高(G+C)mol%革兰氏阳性细菌的其它看家基因,以促进多基因系统进化研究的开展。

基于16S rDNA和看家基因序列分析技术的鲍鱼养殖水体弧菌种类的鉴定

采用TCBS选择性培养基从厦门某鲍鱼养殖场的养殖水体中分离到19株细菌.经16S rDNA序列分析,所有菌株均属于弧菌属(Vibrio),且与最近似的弧菌模式种的同源性都在98.99%以上.由于弧菌种间16S rDNA序列相似度极高,无法仅靠16S rDNA序列比对来鉴定这些菌株到种的水平.16S rDNA序列的系统发育分析也显示,大多数菌株与弧菌模式种无法归为一簇,表明16S rDNA基因在弧菌种的分类鉴定上分辨率不高.进一步采用基于4种看家基因(rpo A、pyr H、gap A和top A)的多位点序列分析技术(MLSA)对分离到的弧菌菌株进行分类鉴定,结果显示19株海洋弧菌归于溶藻弧菌(Vibrio alginalyticus)与魔鬼弧菌(Vibrio diabolicus)2个种,表明这两种弧菌是该鲍鱼养殖场水体环境中的优势弧菌种,在鲍鱼养殖弧菌病害防治方面需要重点关注.此外,看家基因与16S rDNA基因的多态性分析表明,4种看家基因的多态位点比率均高于16S rDNA.4种看家基因串联后的多态位点比率高达41.1%,远高于16S r DNA基因的13.4%,表明看家基因相较于16S rDNA基因有着更高的分辨率,更适合于海洋弧菌的分类鉴定.

钩吻看家基因筛选及生物碱合成相关酶基因的表达分析

钩吻是我国的一种传统中草药,具有重要的药用价值,萜类吲哚生物碱为其主要的活性组分。为了研究钩吻不同部位最适看家基因,以钩吻4个不同部位根皮、茎段、叶片和花序为材料,通过实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR,qRT-PCR),以及GeNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCT和RefFinder软件对10个候选看家基因(18S、GAPDH、Actin、TUA、TUB、SAND、EF-1α、UBC、UBQ和cdc25)进行表达稳定性评估。结果显示,EF-1α在钩吻的4个部位中均稳定表达,为最适的看家基因。同时,为了研究与生物碱合成相关基因的表达情况,基于“基因组+全长转录组+代谢组”共表达模式筛选出钩吻生物碱合成通路上18个相关基因(AS、AnPRT、PRAI、IGPS、TSA、TSB、TDC、GES、G8H、8-HGO、IS、7-DLS、7-DLGT、7-DLH、LAMT、SLS、STR和SGD),以看家基因EF-1α为参照,利用qRT-PCR技术对这18个候选基因表达情况进行分析,结果发现这些基因的表达量与钩吻素己含量变化呈相关性,推测其可能参与钩吻生物碱钩吻素己的合成。

小麦条锈菌看家基因SNP引物的开发及多态性位点研究

利用NCBI数据库进行小麦条锈菌看家基因SNP引物开发,从NCBI搜索到15个基因的序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了22对引物,利用其进行条锈菌DNA的PCR扩增、测序,并与标准序列比对,从而筛选出SNP引物。在候选基因中,柠檬酸盐合酶(Cs)、热休克蛋白hsp90(Hsp)、泛素活化酶E1(Uba)及泛素结合酶E2(Ubc)4个基因的5对SNP引物表现多态性,能检测到条锈菌SNP位点依次为4、6~7、4和7个,均为系统发生信息位点,并摸索出优化的PCR反应体系及条件。利用开发的引物研究条锈菌群体结构,可揭示病原菌起源、进化、传播,为病害治理提供依据。

泛耐药鲍氏不动杆菌看家基因和水平转移基因样本聚类分析

目的了解20株泛耐药鲍氏不动杆菌的菌株亲缘性。方法完成该组泛耐药鲍氏不动杆菌2种与耐药相关的看家基因和54种水平转移获得与β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类耐药相关基因以及13种接合性质粒、转座子、插入序列、整合子等可移动遗传元件遗传标记检测,并对检测结果作样本聚类分析。结果 20株泛耐药鲍氏不动杆菌已经发生演化,并存在2个克隆传播:1-4-6号菌株和2-5-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19号菌株。结论与耐药相关的看家基因和水平转移获得的耐药基因均为显性遗传,本研究耐药菌所观察的表型与之相对应,为追溯耐药菌传播途径提供了方便。

7株肺炎克雷伯菌9种看家基因分子进化分析、多位点序列分型与基因组系统学研究初步报道

我们对β-1株内酰胺类、氨基糖苷类与喹诺酮类药物均耐药的肺炎克雷伯菌（JM45株）进行了全基因组测序（完成图）。美国国立生物信息中心NCBI已收录了6株肺炎克雷伯菌的全基因组序列（截止日2012年10月20日）。

拟诺卡氏菌16S rRNA,gyrB,sod和rpoB基因的系统发育分析

为了更好地了解拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)各物种间的系统发育关系,该属现有有效描述种的gyrB,sod和rpoB基因的部分序列被测定,结合16S rRNA基因,对拟诺卡氏菌属进行了系统发育重建。研究发现拟诺卡氏菌属gyrB,sod和rpoB基因的平均相似性分别为87.7%、87.3%和94.1%,而16S rRNA基因的平均相似性则达到96.65%,3个看家基因均比16S rRNA具有更高的分歧度。比较基于不同基因的系统树发现,由gyrB基因得到的系统树拓扑结构与16S rRNA得到的结构在亚群上基本一致。因此,gyrB基因在拟诺卡氏菌属的系统分类上比16S rRNA基因更具优越性。

一氧化氮合酶基因在先天性巨结肠中的表达

目的 研究神经型一氧化氮合酶 (n NOS)基因在先天性巨结肠 (HD)不同肠段的表达。方法 分别取 8例先天性巨结肠患者病变段和正常段平滑肌组织 ,经处理后提取总 RNA,应用逆转录多聚酶链反应 (RT- PCR)扩增目的基因和看家基因片段 ,观察病变段和正常段的 n NOS基因的表达 ,并与看家基因 (GAPDH)在病变段和正常段的表达作对比。结果 8例患者正常段 n NOS和 GAPDH均有明显的表达 ,病变段 GAPDH亦有明显的表达而 n NOS均无表达。结论 先天性巨结肠患者病变段抑制性神经递质一氧化氮 (NO)减少的原因可能是 n NOS的 m RNA的减少或缺如 。

基因组织特异性相关研究进展

研究基因的组织特异性是了解生命活动进程和组织功能的重要一步.尽管对于看家基因和组织特异基因的研究由来已久,但是对于它们仍缺少统一的定义方式和检测方法.在定义方式上,可以从基因的组织表达数和在各组织间的表达变化情况来分别定义看家基因和组织特异基因.通常将在大多数正常组织中有表达,且表达水平较稳定的基因称为看家基因,而将在一个或少数组织中优势表达的基因定义为组织特异基因或组织选择基因.在检测方法上,高通量实验技术,包括基因芯片、RNA-seq和质谱技术等已成为检测基因组织特异性的主要方法.通过比较多个典型研究的实验结果,发现不同检测方法的覆盖度和灵敏度存在很大差异,其中RNA-seq技术最为灵敏,获得的看家基因数目最多,质谱技术检测出来的看家基因和组织特异基因数目较少,而基因芯片方法给出的多个检测结果间差别较大.尽管不同的定义方式和检测方法所导致的看家基因(或组织特异基因)的集合不完全一致,但不同的看家基因数据集(或组织特异基因)却展现出非常一致的功能和特性.看家基因通常实现所有组织和细胞都必须的基本功能,而看家基因与其他组织表达基因间的相互作用以及组织特异基因间的相互作用则实现了组织的特有功能.同时,基因的组织特异性与疾病之间具有密切联系,相比其他基因,看家基因更有可能成为癌基因,而组织特异基因则更有希望发展成为药物靶标.

反转录实时定量PCR在植物基因表达分析上的研究进展

近年来,反转录实时定量PCR作为一项新的核酸序列定量分析技术以其定量准确、高灵敏度和高通量等特点,已被广泛的应用于分子诊断、病理分析以及食品安全检测等方面。然而其在植物基因表达水平研究上的报道较为少见。在前人研究基础上,总结了反转录实时定量PCR在植物基因综合表达分析、基因家族表达分析、基因差异表达分析、转基因表达分析等方面的应用;分析了反转录、看家基因选择等影响检测基因表达的因素;指出该技术在重复性、灵敏度、标准化上所存在的问题。随着分子生物技术的发展,反转录实时定量PCR将会在植物遗传育种、植物病理检疫以及分子进化等方面发挥更为广泛的作用。

基因表达数据的预处理方法

以看家基因、方差分析及Pearson相关距离结合的数据预处理基因表达方法,运用统计学对看家基因范围做出置信区间并衡量看家基因值,使作为参照物的看家基因更精确。方差分析用以解决实验前后基因表达数据的不一致,去掉误差数据。再利用看家基因调整余下的基因表达数据,从而保证待分析的基因表达数据的正确率。

LASS1基因在鼠脑皮层中的表达研究

目的探讨LASS1基因在大脑衰老中的作用。方法分别从胎鼠、新生鼠、1月龄、3月龄、6月龄、11月龄、18月龄和24月龄鼠大脑皮层组织提取总RNA,RT-PCR扩增获得LASS1的cDNA片段并植入pGEM-T载体,以重组质粒载体为定量标准模板,采用Taqman荧光探针,一步法实时定量RT-PCR检测LASS1mRNA表达,并以肌动蛋白基因(β-actin)和18SrRNA基因作为看家基因。结果在胎鼠至青壮年鼠(1～3个月龄)发育过程中大鼠脑皮层LASS1表达水平呈上调趋势,之后随年龄增长逐渐下降;β-actin表达量在胎鼠及新生鼠明显高于成年鼠和老年鼠;18SrRNA基因表达相对稳定。结论成功建立了大鼠LASS1基因表达的荧光实时定量RT-PCR检测方法;大鼠脑皮层中LASS1基因转录水平随年龄变化呈现相应的规律性,这将为进一步研究该基因在衰老过程中的作用提供实验室依据;同时,作为看家基因用于衰老研究,18SrRNA较β-actin基因更为可靠。

浙东白鹅GAPDH基因的扩增及其在荧光定量PCR中的应用(英文)

三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是一种糖酵解酶,在脊椎动物的所有组织均有稳定的表达,经常作为看家基因来研究基因的表达,本研究分析了鸭GAPDH基因序列,设计了一对引物,利用PCR,RT-PCR技术扩增得到了浙东白鹅的GAPDH基因的DNA序列为235 bp,mRNA序列为209 bp,作为参比基因应用于荧光定量PCR来研究目标基因的表达,目标基因在mRNA水平上的表达量可通过参比基因校正cDNA加入量的不同来研究,荧光定量PCR显示了以cDNA为模板,此引物扩增时Ct具有单一的溶解曲线,说明其表达稳定,可以作为参比基因用于浙东白鹅基因的定量表达研究。

小鼠哮喘模型颈静脉-结状神经节内参基因的筛选

目的观察12个常用看家基因在正常小鼠和哮喘小鼠颈静脉-结状神经节的表达变化,选择合适的内参基因为进一步基因表达分析研究得到可信数据提供依据。方法雌性BALB/c小鼠随机分为哮喘模型组和对照组,制备哮喘模型,用实时荧光定量PCR技术,经geNorm及Normfinder程序分析,评价了12个常用看家基因CYC1、UBC、RPL13、YWHAZ、18srRNA、B2M、SDHA、ATP5B、CANX、ACTB、EIF4A2和GAPDH在小鼠颈-结状神经节的表达稳定性。结果 12个候选看家基因在小鼠神经节的表达差异较大,其中GAPDH、18srRNA、CANX、ACTB和EIF4A2表达相对稳定,而CYC1、UBC和RPL13的表达在两组小鼠神经节变化幅度较大,结合两种分析证实GAPDH是其中最稳定的内参基因。结论本研究结果提示GAPDH是研究哮喘小鼠和正常小鼠颈静脉-结状神经节基因表达的最佳内参基因,同时也为进一步认识在不同实验模型确定适宜内参基因的重要性提供依据。

泛耐药鲍氏不动杆菌与耐药相关基因检测及亲缘性分析

目的了解泛耐药鲍氏不动杆菌(PDR-ABA)的菌株亲缘性。方法对20株PDR-ABA进行3种耐药相关看家基因(carO、gyrA、parC)和54种水平转移获得的与β-内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类药物耐药相关基因以及12种接合性质粒、转座子、插入序列、整合子等可移动遗传元件的遗传标记检测。结果 20株PDR-ABA中检出4种β-内酰胺类获得性耐药基因,5种氨基糖苷类获得性耐药基因,2种获得性抗茵制剂外排泵基因和5种可移动遗传元件。耐药相关看家基因carO、gyrA、parC均存在有义突变。结论 PDR-ABA存在5个克隆传播,其中1-3-4-5-9-15-16-18-20号菌株呈流行趋势。

幽门螺杆菌jhp基因与胃十二指肠疾病的关系

幽门螺杆菌（H.pylori）是一类基因组结构变异较大的细菌。除具有一般共同特征、看家基因、插入序列、致病岛和质粒外，还具有特殊的毒力基因。H.pylori基因组结构的不断阐明。为其临床和流行病学研究以及感染的预防和控制打下了坚实的基础。新发现的H.pylori致病因子，如jhp0917-0918、jhp0947和jhp0949基因均与胃十二指肠疾病相关。提示其可能成为H.pylori新的流行病学标志。

利用抑制消减杂交技术研究一氧化碳对小鼠小脑基因表达的影响

目的 筛选 2 5mmol·L- 1一氧化碳小鼠吸入染毒 72h后 ,小鼠小脑中的差异表达基因。方法6 0只成年雄性昆明种小鼠随机分为对照组和染毒组 ,30只 /组。由Qiagen公司mRNAMiniKit直接提取小脑组织的mRNA ,PCR SelectTM cDNASubtractionKit构建消减文库 ,GenBank分析差异表达基因。结果 实验中共得到 2 0个阳性克隆 ,抽提重组质粒后测序 ,除去 3条重复的克隆片段 ,获得了 17个表达序列标签。其中 ,16条序列同源分数较高 ,是已知序列或与已知的表达序列标签有部分重叠的。 1条(T15 )同源分数较低。结论 抑制消减杂交是一种优良的寻找新基因的方法。一氧化碳主要影响的差异表达基因的类别包括细胞间通讯的基因差异表达、线粒体看家基因异常表达。