M2型丙酮酸激酶、缺氧诱导因子-1α在子宫内膜癌组织中的表达及与患者临床特征的关系

目的探讨M2型丙酮酸激酶(PKM2)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在子宫内膜癌(EC)组织中的表达及与患者临床特征的关系。方法取41例EC患者的EC组织及相应癌旁组织和10例子宫内膜良性疾病患者的正常子宫内膜组织。采用免疫组化法检测PKM2、HIF-1α的表达情况。比较EC组织、癌旁组织及正常子宫内膜组织中PKM2、HIF-1α的阳性表达率及不同临床特征EC患者EC组织中PKM2、HIF-1α的表达情况。结果EC组织中HIF-1α的阳性表达率明显高于癌旁组织和正常子宫内膜组织,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。p53突变型、分化程度为低分化EC患者EC组织中PKM2的阳性表达率分别明显高于p53野生型、分化程度为中高分化患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。有脉管浸润的EC患者EC组织中HIF-1α的阳性表达率高于无脉管浸润患者,差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论HIF-1α在EC组织中的阳性表达率较高。PKM2、HIF-1α表达与EC患者的临床特征有关,或可作为EC患者的有效治疗靶点。

胰岛素样生长因子1对人RPE细胞分泌TGF-β2、MMP-2的影响及机制研究

目的研究胰岛素样生长因子1(IGF-1)对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)表达转化生长因子β2(TGF-β2)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)的影响,并探索其作用机制。方法ARPE-19细胞分别按不同浓度IGF-1和不同浓度LY294002培养6 h、12 h、24 h、48 h,采用CCK-8法检测细胞活力,确定IGF-1、LY294002的最佳作用浓度与时间。细胞划痕法检测细胞迁移活性。ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β2浓度。将ARPE-19细胞分为对照组、IGF-1组(80μg·L^(-1) IGF-1)、IGF-1+LY294002组(80μg·L^(-1) IGF-1+30 mmol·L^(-1) LY294002)、LY294002组(30 mmol·L^(-1) LY294002),使用无血清DMEM/F12培养基培养,对照组不做任何处理,分别采用RT-PCR、Western blot检测细胞中TGF-β2、MMP-2、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)的mRNA和蛋白表达量。结果与0μg·L^(-1) IGF-1比较,80μg·L^(-1) IGF-1的细胞活力24 h变化显著(P<0.05),故确定其为IGF-1最佳作用浓度和时间。与0 mmol·L^(-1) LY294002比较,24 h的30 mmol·L^(-1) LY294002接近半数抑制浓度,故确定其为LY294002最佳作用时间和浓度。细胞划痕法检测结果显示,0μg·L^(-1) IGF-1组、40μg·L^(-1) IGF-1组、80μg·L^(-1) IGF-1组细胞迁移率整体比较及两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。ELISA检测结果显示,0μg·L^(-1) IGF-1组、40μg·L^(-1) IGF-1组、80μg·L^(-1) IGF-1组细胞上清液中TGF-β2浓度整体比较及两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。RT-PCR、Western blot检测结果显示,IGF-1、LY294002培养24 h,与对照组比较,IGF-1组细胞中TGF-β2、MMP-2、PI3K、AKT的mRNA与蛋白表达水平均升高,而LY294002组细胞中TGF-β2、MMP-2、PI3K、AKT的mRNA与蛋白表达水平均下降(均为P<0.05);与IGF-1组比较,IGF-1+LY294002组细胞中TGF-β2、MMP-2、PI3K、AKT的mRNA与蛋白表达水平均下降(均为P<0.05)。结论IGF-1能促进ARPE-19细胞增殖、迁移;IGF-1可能通过PI3K/AKT信号通路上调ARPE-19细胞中TGF-β2、MMP-2的表达,参与近视的发生与发展。

脑和肌肉ARNT样蛋白1、周期昼夜节律调节因子2、Notch1、糖原合成酶激酶-3β在结直肠腺癌组织中的表达及意义

目的探讨脑和肌肉ARNT样蛋白1(BMAL1)、周期昼夜节律调节因子2(PER2)、Notch1、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)在结直肠腺癌组织中的表达及意义。方法实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测11例结直肠癌患者手术切除的新鲜结直肠癌组织及相应癌旁组织中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3βmRNA的相对表达量;免疫组化法检测50例手术切除的结直肠腺癌及癌旁组织、30例经内镜切除的结直肠腺瘤组织中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白的表达情况。结果结直肠癌组织中,BMAL1、PER2 mRNA的相对表达量均低于癌旁组织,差异均有统计学意义(P﹤0.05);结直肠癌组织和癌旁组织中Notch1、GSK-3βmRNA的相对表达量比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05)。免疫组化结果显示,结直肠腺癌组织、结直肠腺瘤组织及结直肠腺癌癌旁组织中,BMAL1、PER2的表达呈递增趋势,而Notch1、GSK-3β的表达呈递减趋势。淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期结直肠腺癌患者结直肠腺癌组织中BMAL1、Notch1蛋白表达均高于无淋巴结转移、TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期患者(P﹤0.05);病理类型为黏液腺癌的结直肠腺癌组织中PER2蛋白的表达高于管状腺癌(P﹤0.05),GSK-3β的表达低于管状腺癌(P﹤0.05)。Spearman相关分析结果显示,结直肠癌组织中BMAL1的表达与PER2的表达呈正相关(r=0.332,P=0.018),PER2的表达与GSK-3β的表达呈负相关(r=-0.291,P=0.040),Notch1的表达与GSK-3β的表达呈正相关(r=0.285,P=0.045),其余指标间的表达无相关性。结论BMAL1、Notch信号通路、GSK-3β均可能参与调控结直肠癌的发生、发展过程,且GSK-3β可能与BMAL1和Notch信号通路之间存在相互调控作用。

非酒精性脂肪性肝病中蛋白激酶R样内质网激酶/真核翻译起始因子-2α通路的变化及意义

目的:又见察蛋白激酶R样内质网激酶/真核翻译起始因子-2α(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase/eukaryotic translation initator factor-2α,PERK/eIF-2α)信号通路在大鼠实验性非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)中的变化并探讨该信号通路在NAFLD中可能的作用.方法:健康Wistar大鼠30只,雌雄不限,按照随机数字表法分为正常对照组和NAFLD组,每组各15只.NAFLD组大鼠采用高脂高糖饮食诱导NAFLD的发生,而正常对照组大鼠则给予普通饲料喂养,时间总计为16 wk.检测血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三醋(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein,HDL)和低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein,LDL)的含量;实时荧光定量PCR技术检测肝脏中PERK,eIF-2α、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)及葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)等指标在mRNA水平的表达改变;蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测肝脏中磷酸化PERK(pPERK),磷酸化eIF-2α(p-eIF-2α),CHOP及GRP78等指标在蛋白水平的改变;同时采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果:NAFLD组大鼠血清中TC、TG、LDL含量较正常对照组明显增高(P<0.05),而HDL则明显低于正常对照组大鼠(P<0.05);PCR结果发现,NAFLD组大鼠肝组织中PERK,eIF-2α、CHOP及GRP78的mRNA表达水平均较正常对照组大鼠显著升高(P<0.05或P<0.01):同时Western blot结果显示NAFLD大鼠肝脏中p-PERK,p-eIF-2α,CHOP及GRP78等指标的蛋白水平表达较正常对照组大鼠明显增多(P<0.05);此外,流式细胞仪检测发现NAFLD大鼠肝细胞凋亡较正常对照组大鼠显著升高.结论:NAFLD的发生发展过程中可能有内质网应激诱导细胞凋亡通路PERK/eIF-2α的参与.

真核细胞延伸因子2激酶(eEF2K)在胶质母细胞瘤发病机制中的作用

目的胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)具有高度的异质性和侵略性。真核细胞延伸因子2激酶(eEF2K)在多种肿瘤中均过表达,但其在GBM中的作用尚不清楚。本研究基于肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中的数据,旨在阐明eEF2K与GBM的关系。方法通过TCGA数据库用Wilcoxon检验和配对检验了解eEF2K在GBM和正常组织中eEF2K的表达水平。制作受试者工作特征(ROC)曲线,利用曲线下面积(AUC值)评价eEF2K作为二元分类法的价值。Cox回归分析和Kaplan-Meier曲线用于评估eEF2K mRNA表达与预后的相关性。基因集富集分析(GSEA)被用于阐明eEF2K在GBM中的生物学功能。结果与正常组织相比,eEF2K在GBM组织中的表达显著升高(P<0.001)。ROC曲线显示eEF2K对GBM的诊断能力较低(AUC=0.697)。Kaplan-Meier生存分析显示eEF2K高表达与GBM患者预后无关。GSEA发现eEF2K的表达与G-alpha(s)信号通路、亨廷顿病(Huntington disease)、阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)、TP53调节代谢基因、线粒体中的电子传输链、反应性生物氧化有关,而ssGSEA显示eEF2K的表达与多种免疫细胞浸润水平有关。结论eEF2K在GBM中上调并不能作为预后不良的生物标志,但是参与GBM中多种免疫细胞浸润。此外,eEF2K在GBM中的生物学功能可能与G-alpha(s)、TP53调节代谢基因、线粒体中的电子传输链、反应性生物氧化有关。这些发现有助于阐明eEF2K在肿瘤发生中的作用,为进一步研究奠定基础。

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和丝裂原活化蛋白激酶/细胞信号调节激酶1/2信号通路抑制剂对乳腺癌细胞缺氧诱导因子-2α表达的影响

目的探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和丝裂原活化蛋白激酶/细胞信号调节激酶1/2(MEK/ERK1/2)信号通路抑制剂对缺氧诱导的乳腺癌MCF-7细胞中缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)表达的影响。方法乳腺癌MCF-7细胞常规培养24 h后,分为常氧组、缺氧组、缺氧+低剂量LY294002组、缺氧+高剂量LY294002组,缺氧+低剂量U0126组和缺氧+高剂量U0126组。常氧组细胞使用含生理盐水的RPMI 1640培养基,缺氧组细胞使用含100μmol·L-1氯化钴的RPMI 1640培养基,缺氧+低剂量LY294002组细胞使用含100μmol·L-1氯化钴和4μmol·L-1 LY294002的RPMI 1640培养基,缺氧+高剂量LY294002组细胞使用含100μmol·L-1氯化钴和40μmol·L-1 LY294002的RPMI 1640培养基,缺氧+低剂量U0126组细胞使用含100μmol·L-1氯化钴和2μmol·L-1 U0126的RPMI 1640培养基,缺氧+高剂量U0126组细胞应用含8μmol·L-1 U0126的RPMI 1640培养基,继续培养3 h。采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测各组细胞HIF-2αmRNA的表达;采用Western blot法检测各组细胞HIF-2α蛋白、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白的表达。结果缺氧组细胞中HIF-2αmRNA相对表达量及HIF-2α蛋白、p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相对表达量高于常氧组(P<0.05);缺氧+低剂量LY294002组、缺氧+高剂量LY294002组、缺氧+低剂量U0126组、缺氧+高剂量U0126组细胞中HIF-2αmRNA相对表达量及HIF-2α蛋白、p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相对表达量低于缺氧组(P<0.05)。缺氧+高剂量LY294002组细胞中HIF-2αmRNA相对表达量及HIF-2α蛋白、p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相对表达量低于缺氧+低剂量LY294002组(P<0.05);缺氧+高剂量U0126组细胞中HIF-2αmRNA相对表达量及HIF-2α蛋白、p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相对表达量低于缺氧+低剂量U0126组(P<0.05)。结论PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信号通路可能是缺氧诱导HIF-2α表达的上游信号通路,在缺氧条件下对HIF-2α具有正向调节作用,在乳腺癌的发生、发展中发挥重要作用。

中国人青年发病的成年型糖尿病/2型糖尿病家系葡萄糖激酶和肝细胞核因子-1α基因缺陷的分子筛查

目的 :探索包含青年发病的成年型糖尿病 ( maturity- onset diabetes of the young,MODY)患者的 2型糖尿病家族中可能存在的 MODY基因的致病突变。方法 :选择 MODY基因中突变率最高的葡萄糖激酶 ( glucokinase,GCK,MODY2 )和肝细胞核因子- 1α( hepatic nuclear factor- 1α,HNF- 1α,MODY3 )基因的微卫星多态遗传标志 ,在一个包含 2名 MODY患者的中国人 2型糖尿病家系中进行连锁分析 ,对可能与疾病连锁的基因进行全基因外显子的突变筛查—— DNA序列直接测定以明确具体的碱基突变和所编码的氨基酸的改变。结果 :家系 5 0 0 0 1中 MODY3的最大 L OD( logarithm of odds)值达到 2 .3 75 93 0 (θ=0 .0 0 0 0 0 0 ) ,但未发现与MODY2连锁的依据。 DNA直接测序发现在家系 5 0 0 0 1中所有家族成员 MODY3基因外显子 7中存在一个杂合多态 Ser4 87Asn( AGC/ AAC) ,该多态在正常人中也可见到。结论 :GCK基因内或附近的基因变异不是本家系 2型糖尿病的主要致病原因 ;HNF- 1α基因的启动子和所有外显子内均未发现明确的致病突变 ,但无法否定内含子或其他调节区域的变异有可能的致病倾向 ;也不能排除HNF- 1α基因附近其他未知疾病基因的致病可能。本家系的致病基因有待进一步明确。

真核翻译起始因子-5A2在乳腺癌中的表达及其临床意义

目的探讨真核翻译起始因子-5A2在乳腺癌组织中的表达的临床意义。方法收集我院2008年1月至2010年12月有完整存档蜡块资料的50例乳腺癌蜡块并对其进行免疫组织化学染色,检测EIF-5A2在乳腺癌中的表达,并且对EIF-5A2的表达情况与疾病的病理生物学特点进行分析,以判断其对预后的意义。结果 EIF-5A2阳性表达86%,EIF-5A2在肿瘤中的表达与肿瘤临床分期、淋巴结转移、与雌激素受体(ER)状态呈负相关。结论 EIF-5A2在乳腺癌中有高表达,与临床分期密切相关。

磷酸腺苷激活的蛋白激酶参与调节细胞外信号调节激酶1/2活化发挥对血管平滑肌细胞胰岛素样生长因子-1信号的抑制作用

目的进一步证实在猪主动脉平滑肌细胞中磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抑制胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)刺激引起的细胞增生,以及探讨其可能的机制。方法使用AMPK活化剂二甲双胍增强细胞内AMPK的活化(表现为AMPK第172位苏氨酸磷酸化增高);采用定点突变获得组成性激活型AMPK突变体,设计短发卡RNA (short hairpin,shRNA)序列构建AMPK干扰载体,并分别包装产生组成性激活型AMPK和AMPK敲低慢病毒。分别采用AMPK活化剂二甲双胍处理、组成性激活型AMPK慢病毒感染和AMPK敲低慢病毒感染猪主动脉平滑肌细胞,观察AMPK活性对猪主动脉平滑肌细胞中IGF-1刺激引起的细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases 1/2,ERK1/2)活性(表现为202位苏氨酸和204位酪氨酸的磷酸化)及其下游细胞增生的影响。结果二甲双胍明显增强AMPK的活性(表现为172位苏氨酸磷酸化增高),并明显抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化(表现为202位苏氨酸和204位酪氨酸的磷酸化受到抑制);组成性激活型AMPK表达能明显抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化以及下游的细胞增生;在AMPK敲低细胞中,IGF-1能引起更强的ERK1/2活化。结论 AMPK能通过抑制ERK1/2活化抑制血管平滑肌细胞IGF-1信号,并能抑制IGF-1刺激引起的血管平滑肌细胞增生。

真核翻译延伸因子1A2及真核延长因子1A2在肿瘤中的作用

癌基因一般是信号传导通路中重要的基因或细胞表面受体激酶，以往的研究主要集中在这些调节基因，相对忽略了管家基因（翻译因子、转录因子和一些维持细胞最基本功能的酶等）可能具有的致癌作用。通常认为管家基因蛋白水平和功能相对稳定保守，主要维持细胞基本结构和功能。

miR-192-5p靶向CKIP-1促进骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化

背景:酪蛋白激酶2结合蛋白1(casein kinase 2-interaction protein-1,CKIP-1)是一种重要的骨形成负调控基因,其敲除鼠骨质显著增强、骨形成和骨密度也显著提高。而miRNA作为较早发现的小分子调控物,对大多数编码基因具有调控作用,在成骨分化中发挥重要作用。目的:探讨miRNA/CKIP-1对骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其分子机制。方法:采用miRNA-Seq技术检测2022年3-6月在开封市中心医院骨外科就诊32例骨质疏松患者及同期体检中心健康人群骨髓间充质干细胞中miRNA的变化情况;利用Targetscan网站预测靶向调控CKIP-1的miRNA,利用荧光素酶报告基因实验检测miRNA与CKIP-1启动子区DNA的结合;在骨髓间充质干细胞中转染miR-192-5p类似物(miR-192-5p mimics)/阴性对照(NC mimics)或miR-192-5p抑制剂(miR-192-5p inhibitor)/阴性对照(NC inhibitor),成骨诱导后第7,14天,通过实时荧光定量PCR技术及茜素红染色检测成骨标志基因Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素、抗骨桥蛋白、骨唾液蛋白及CKIP-1的表达水平和骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的情况;采用蛋白质免疫印迹实验及茜素红染色检测miR-192-5p/CKIP-1/轴对细胞成骨分化的的调控作用。结果与结论:与健康组相比,骨质疏松组有16个miRNA表达明显升高,53个miRNA表达明显降低(P<0.05);利用Targetscan网站预测,并通过荧光素酶报告基因实验验证,发现miR-192-5p与CKIP-1有互补的核苷酸序列(P<0.05);过表达miR-192-5p,Runx2、骨钙素、骨桥素和骨唾液蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),抑制miR-192-5p,Runx2、骨钙素、骨桥素和骨唾液蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),而沉默CKIP-1的表达后,Runx2、骨钙素及骨桥素的蛋白水平增加(P<0.05),逆转了敲低miR-192-5p对细胞成骨分化的抑制作用。上述结果证实,miR-192-5p在骨质疏松症中表达降低;miR-192-5p通过靶向抑制CKIP-1的表达,促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

胰腺导管腺癌中真核翻译起始因子5A2和基质金属蛋白酶-10、-11的表达

目的检测胰腺导管腺癌组织中真核翻译起始因子(EIF) 5A2、基质金属蛋白酶(MMP)-10和MMP-11表达,关注其相关性。方法 53例经病理医师确诊的胰腺导管腺癌为观察组,15例肿瘤周围正常胰腺组织为对照组。应用免疫组化法检测两组中EIF5A2、MMP-10和MMP-11蛋白的表达。结果两组EIF5A2、MMP-10和MMP-11表达差异有统计学意义(P<0. 05),观察组EIF5A2、MMP-10和MMP-11表达与Ki67指数和脉管累犯有关,EIF5A2表达与神经累犯密切相关,MMP-10和MMP-11表达与淋巴结转移相关(P<0. 05)。三者均与性别、年龄、分化程度及炎细胞浸润无关(P>0. 05)。观察组EIF5A2和MMP-10、EIF5A2和MMP-11表达呈正相关。结论胰腺导管腺癌中EIF5A2、MMP-10、MMP-11三者高表达可以促进肿瘤的形成和进展,EIF5A2与MMP-10、MMP-11可能具有正向协同作用。

TFAP2A基因重组真核表达载体的构建及鉴定

目的构建转录因子增强子结合蛋白-2α的真核表达载体并进行鉴定,为TFAP2A的后续研究提供有效工具。方法采用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对真核表达载体CV702质粒进行酶切获得线性化载体;通过PCR扩增制备TFAP2A的cDNA片段,将线性化载体和TFAP2A的cDNA扩增产物进行体外环化连接,构建CV702-TFAP2A重组质粒。将连接产物进行细菌转化,挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定,对阳性克隆进行测序及结果分析。将CV702-TFAP2A重组真核表达载体转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,通过Western blot检测TFAP2A的表达效率。结果菌落PCR扩增和测序结果显示,CV702-TFAP2A重组真核表达载体构建成功;Western blot结果与Image J灰度值分析结果显示,与CV702对照载体相比,转染CV702-TFAP2A重组质粒的MDA-MB-231中的Flag-TFAP2A蛋白相对表达量更高(P<0.05)。结论成功构建CV702-TFAP2A的重组真核表达载体,证实转染CV702-TFAP2A的细胞中Flag-TFAP2A的表达水平升高。

真核翻译起始因子-5A2 在肝内胆管癌中的表达及意义

目的研究真核翻译起始因子-5A2(eukaryotic translation initiation factor 5A2,eIF5A2)在肝内胆管癌中的表达及与神经侵犯和周围脂肪组织浸润的相关性。方法收集昆明医科大学第二附属医院肝胆胰外科2013年10月至2020年10月156例肝内胆管癌患者术后石蜡切块,收集同期30例肝血管瘤患者部分肝切除的正常肝组织作为对照组,采用免疫组化的方法检测eIF5A2的表达水平,并收集病理资料,分析eIF5A2与神经侵犯和周围脂肪组织浸润的相关性。结果156例肝内胆管癌组织切片中eIF5A2高表达95例(60.9%),其在正常肝组织胆管上皮高表达率为13.3%,eIF5A2的表达与神经侵犯和周围脂肪组织浸润显著相关(P<0.05)。结论eIF5A2在肝内胆管癌中高表达,与神经侵犯和周围脂肪组织浸润显著相关。

胰岛素样生长因子-1通过细胞外信号调节激酶1/2通路下调转录因子基本转录元件结合蛋白表达抗心肌细胞凋亡

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对大鼠心肌细胞凋亡保护作用的基因调控机制。方法体外培养新生大鼠心肌细胞,10nmol/L IGF-1刺激的同时,分别加入磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2和Raf-1 3条通路抑制剂(20μmol/L),通过RT-PCR及Western blotting方法观察IGF-1调节基本转录元件结合蛋白(BTEB)的基因表达及其通路调控。100μmol/L H2O2处理诱导心肌细胞凋亡,通过DNA梯度分析、Annexin V-FITC/PI双染色法、Caspase-3活性测定、Hoechest33258染色法观察用BTEB特异性siRNA人为下调BTEB基因表达后对心肌细胞凋亡的影响。结果大鼠心肌细胞经IGF-1刺激60min后,BTEB mRNA和蛋白表达均明显下降;与对照组相比,加入ERK1/2通路抑制剂PD98059组BTEB的mRNA和蛋白表达均明显增高(P<0.01);H2O2诱导的大鼠心肌细胞于下调BTEB表达后,DNA片段化改善,心肌细胞凋亡率下降(P<0.05),Caspase-3活性降低(P<0.05),凋亡小体减少,与IGF-1的抗心肌细胞凋亡效果相似。结论 IGF-1可以通过ERK1/2通路下调转录因子BTEB基因表达而发挥抗心肌细胞凋亡的作用。

核转录因子-κB、细胞外信号调节激酶1/2、转移相关蛋白-3在乳腺肿瘤组织中的表达研究

目的分析核转录因子-κB(NF-κB)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、转移相关蛋白-3(MTA-3)在乳腺肿瘤中的表达。方法选取我院2017年8月至2019年3月收治的60例乳腺肿瘤患者作为观察组,另取30例同期乳腺增生患者作为对照组。比较两组患者组织样本NF-κB、ERK1/2和MTA-3水平。结果观察组NF-κB、ERK1/2阳性检出率高于对照组;MTA-3阳性检出率低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);临床分期越高者、肿瘤直径越大者,NF-κB、ERK1/2阳性检出率越高,MTA-3阳性检出率低越低,差异有统计学意义(P<0.05)。Luminal A型、Luminal B型及HER2阳性分子分型患者NF-κB、ERK1/2阳性检出率高于三阴型,MTA-3阳性检出率低于三阴型,差异有统计学意义(P<0.05)。淋巴结转移患者NF-κB、ERK1/2阳性检出率高于对照组,MTA-3阳性检出率低于无转移患者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在乳腺肿瘤组织中存在NF-κB和ERK1/2的高阳性表达和MTA-3和低表达,并且与乳腺增生患者病理组织表达有明显差异,结合三者指标分析对鉴别诊断乳腺肿瘤、改善乳腺肿瘤干预时机有重要意义。

心脏转录因子Nkx2-5、GATA-4真核表达质粒的构建

目的:构建人类心脏特异性转录因子Nkx2-5、GATA-4的真核表达质粒,探讨Nkx2-5、GATA-4在心脏发育及先天性心脏病发病过程中的作用奠定基础。方法:以质粒人脑c DNA为模板,并设计上下游引物扩增Nkx2-5、GATA-4编码区序列。将真核表达载体pCDNA 3.1-HA、pCDNA 3.1-flag分别和Nkx2-5、GATA-4的PCR产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCDNA 3.1-HA-Nkx2-5、pCDNA 3.1-flag-GATA-4,转化至大肠杆菌,质粒抽提后经PCR、双酶切及测序鉴定。结果:成功设计引物扩增出Nkx2-5、GATA-4基因编码区约1 kbp及1.3 kbp的目的片段,PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的Nkx2-5、GATA-4基因序列。结论:成功构建了含有Nkx2.5、GATA4的真核表达重组质粒,为后续研究奠定基础。

肝细胞癌中真核延伸因子1A2的表达及意义

【目的】探讨真核延伸因子1A2(eEF1A2)在肝细胞癌(HCC)中的表达及其临床病理意义。【方法】收集104例HCC患者的临床病理资料,利用组织芯片对其癌及癌旁肝组织进行免疫组化检测,应用统计学方法分析eEF1A2在这些组织中的表达水平及与患者临床病理特征的关系。【结果】免疫组化结果显示:56.7%肝癌组织中eEF1A2高表达(eEF1A2++,eEF1A2+++),而仅13.5%的癌旁肝组织呈高表达,差异具有统计学意义(P=0.014)。eEF1A2的表达与乙肝病毒感染(P=0.030)和复发(P=0.012)相关。Kaplan-Meier分析表明:eEF1A2高表达患者的总体生存时间(P=0.024)和无复发生存时间(P=0.023)较eEF1A2低表达患者更长。多因素Cox回归分析提示:eEF1A2表达为影响HCC患者总体生存的独立危险因素(P=0.038)。【结论】HCC中eEF1A2蛋白表达增高,与肝癌患者术后复发和预后相关,eEF1A2可以作为判断肝癌患者预后的潜在分子标志物。

鸟苷酸解离抑制因子-2真核表达载体构建及稳定转染A549细胞株的建立

目的构建Rab蛋白鸟苷酸解离抑制因子-2(GDI2)真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法聚合酶链反应(PCR)扩增GDI2基因片段,构建pcDNA3.1-GDI2真核表达载体,经酶切、PCR、测序验证其正确性,脂质体法转染真核细胞A549,G418筛选建立稳定转染的细胞株。免疫印迹法检测稳定转染的细胞株。结果构建了真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达GDI2蛋白。结论 GDI2真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为研究GDI2过度表达对肿瘤侵袭和转移的影响奠定了实验基础。

电针调控PI3K/Nrf2/HO-1通路对T2DM大鼠肾脏保护作用的研究

目的:观察电针对糖尿病大鼠肾脏磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)通路的影响,探讨其对肾脏的保护机制。方法:将18只雄性Wistar大鼠随机分为空白组、模型组和电针组,每组6只。本研究采用2%链脲佐菌素溶液(35 mg/kg)注射于腹腔并饲以高糖高脂饲料构建2型糖尿病大鼠模型。电针组取双侧“胃脘下俞”“脾俞”“足三里”“三阴交”干预,于同侧“足三里”“胃脘下俞”给予电针刺激,1次/d,连续6周。于造模前、电针前后测量空腹血糖(FBG);酶比色法检测血清丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)及尿素(UREA)含量;荧光免疫法检测血清活性氧(ROS)含量;HE染色观察肾脏形态学变化;蛋白免疫印迹法检测肾脏PI3K、蛋白激酶B(Akt)、Nrf2和HO-1蛋白表达情况。结果:干预前,与空白组比较,模型组、电针组大鼠FBG均升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。干预6周后,与空白组比较,模型组大鼠血清FBG、MDA、ROS及UREA水平均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01),血清SOD含量、肾脏PI3K、Akt、Nrf2及HO-1蛋白表达均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,电针组大鼠血清FBG、MDA、ROS及UREA水平均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01);血清SOD含量、肾脏PI3K、Akt、Nrf2及HO-1蛋白表达均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。HE染色显示模型组较空白组病理改变明显,电针组整体情况优于模型组。结论:电针可明显降低2型糖尿病大鼠氧化应激水平并缓解大鼠肾脏内部形态的病理性改变,对肾脏的保护机制或与激活PI3K/Nrf2/HO-1通路相关。