真核细胞延伸因子2激酶(eEF2K)在胶质母细胞瘤发病机制中的作用

目的胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)具有高度的异质性和侵略性。真核细胞延伸因子2激酶(eEF2K)在多种肿瘤中均过表达,但其在GBM中的作用尚不清楚。本研究基于肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中的数据,旨在阐明eEF2K与GBM的关系。方法通过TCGA数据库用Wilcoxon检验和配对检验了解eEF2K在GBM和正常组织中eEF2K的表达水平。制作受试者工作特征(ROC)曲线,利用曲线下面积(AUC值)评价eEF2K作为二元分类法的价值。Cox回归分析和Kaplan-Meier曲线用于评估eEF2K mRNA表达与预后的相关性。基因集富集分析(GSEA)被用于阐明eEF2K在GBM中的生物学功能。结果与正常组织相比,eEF2K在GBM组织中的表达显著升高(P<0.001)。ROC曲线显示eEF2K对GBM的诊断能力较低(AUC=0.697)。Kaplan-Meier生存分析显示eEF2K高表达与GBM患者预后无关。GSEA发现eEF2K的表达与G-alpha(s)信号通路、亨廷顿病(Huntington disease)、阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)、TP53调节代谢基因、线粒体中的电子传输链、反应性生物氧化有关,而ssGSEA显示eEF2K的表达与多种免疫细胞浸润水平有关。结论eEF2K在GBM中上调并不能作为预后不良的生物标志,但是参与GBM中多种免疫细胞浸润。此外,eEF2K在GBM中的生物学功能可能与G-alpha(s)、TP53调节代谢基因、线粒体中的电子传输链、反应性生物氧化有关。这些发现有助于阐明eEF2K在肿瘤发生中的作用,为进一步研究奠定基础。

真核翻译延伸因子1A2及真核延长因子1A2在肿瘤中的作用

癌基因一般是信号传导通路中重要的基因或细胞表面受体激酶，以往的研究主要集中在这些调节基因，相对忽略了管家基因（翻译因子、转录因子和一些维持细胞最基本功能的酶等）可能具有的致癌作用。通常认为管家基因蛋白水平和功能相对稳定保守，主要维持细胞基本结构和功能。

YAP通过调控EEF1A2的表达促进肝癌细胞的迁移和侵袭

目的:研究Yes相关蛋白(yes-associated protein,YAP)通过调控真核细胞翻译延伸因子1A2(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2,EEF1A2)的表达促进肝癌细胞迁移和侵袭的机制。方法:通过建立YAP和EEF1A2干扰表达或过表达的SMMC-7721和SK-HEP1肝癌细胞模型,采用Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的改变;应用反转录和实时定量PCR(reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)和Western blot法检测相关基因的mRNA和蛋白表达水平;利用染色质靶向酶切检测(cleavage under targets and release using nuclease,CUT&RUN)-qPCR实验检测YAP能否与EEF1A2基因的启动子序列结合。结果:EEF1A2在肝癌组织中高表达,并与肝癌细胞的迁移能力呈正相关;EEF1A2可以促进低迁移能力的SMMC-7721细胞和高迁移能力的SK-HEP1细胞迁移和侵袭,调控细胞中上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志物Snail和E-cadherin的表达;YAP可以上调EEF1A2的表达而促进肝癌细胞的迁移和侵袭;CUT&RUN-qPCR实验结果显示YAP可以与EEF1A2基因的启动子序列结合。结论:YAP可以通过与EEF1A2基因的启动子序列结合,促进EEF1A2的表达,进一步促进肝癌细胞的迁移和侵袭。

针刺对创伤后应激障碍大鼠海马蛋白激酶R样内质网激酶/真核细胞起始因子2α信号通路相关蛋白的影响

目的:观察针刺对创伤后应激障碍(PTSD)大鼠海马蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/真核细胞起始因子2α(eIF2α)信号通路的影响,探讨针刺治疗PTSD的可能机制。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、针刺组、舍曲林组,每组7只。采用单次延长应激法制备PTSD大鼠模型。针刺组针刺“百会”“大椎”,每次10min,每日1次,连续7d;舍曲林组给予盐酸舍曲林溶液(10mg/kg)灌胃,连续7d。采用高架十字迷宫实验、新物体识别实验检测大鼠行为学变化;Westernblot法检测大鼠海马PERK、磷酸化(p)-PERK、eIF2α、p-eIF2α、转录激活因子4(ATF4)蛋白表达;透射电镜观察大鼠海马神经元超微结构。结果:与正常组比较,模型组大鼠高架十字迷宫实验开臂次数百分比和开臂时间百分比、新物体识别指数显著降低(P<0.01);海马p-PERK、p-eIF2α、ATF4蛋白表达显著升高(P<0.05)。与模型组比较,针刺组、舍曲林组大鼠高架十字迷宫实验开臂次数百分比和开臂时间百分比、新物体识别指数显著升高(P<0.05,P<0.01),海马p-PERK、p-eIF2α、ATF4蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01),舍曲林组eIF2α蛋白表达显著降低(P<0.05)。与正常组比较,模型组海马神经元损伤,粗面内质网重度扩张,线粒体多呈嵴减少或少量空泡化;与模型组比较,针刺组、舍曲林组海马神经元结构损伤减轻,粗面内质网未见明显扩张,部分线粒体呈嵴减少。结论:针刺可以缓解PTSD大鼠焦虑行为和提高识别记忆能力,其机制可能与抑制海马PERK/eIF2α信号通路,改善内质网应激造成的海马神经元损伤有关。

Mnk2和eIF4E在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义

目的:探讨MAPK相互作用激酶-2(MAPK-interacting kinase-2,Mnk2)和真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)在食管鳞状细胞癌中的表达及其与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关系。方法:收集临床食管鳞癌石蜡标本98例及正常食管黏膜上皮组织20例,应用免疫组化SP法检测癌组织及正常食管黏膜组织中Mnk2和eIF4E的表达,并分析其与食管鳞癌临床病理特征的关系。结果:Mnk2在食管癌组织中的阳性率68.4%(67/98),eIF4E的阳性率为61.2%(60/98),Mnk2与eIF4E表达呈正相关(P<0.05),且Mnk2蛋白过表达与食管鳞癌的浸润深度、病理分期密切相关(P<0.05)。结论:Mnk2在食管癌组织中的过表达与浸润深度、TNM分期有关,同时与eIF4E在食管癌的表达相关,两者在食管癌的发展中有协同作用。

P53对蛋白激酶R和宫颈癌HeLa细胞生物学行为的影响

目的探讨P53蛋白对蛋白激酶R(PKR)表达和活性以及对宫颈癌He La细胞生物学行为的影响。方法构建过表达p53基因的重组质粒p EGFP-C1/p53,转染He La细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测p EGFP-C1/p53转染组、空质粒p EGFP-C1转染组及空白对照组(仅加入转染试剂)p53及PKR m RNA的表达;采用Western Blot法检测上述3组中P53、PKR、磷酸化型PKR(p-PKR),PKR下游底物真核细胞翻译启始因子2α(e IF2α)的磷酸化型p-e IF2α的表达;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测He La细胞增殖活性变化,Transwell侵袭实验检测He La细胞侵袭能力变化。结果 p EGFP-C1/p53转染组p53及PKR m RNA的相对表达量高于p EGFP-C1转染组和空白对照组(均P<0.05),p EGFP-C1转染组和空白对照组比较,差异无统计学意义;p EGFP-C1/p53转染组P53、PKR、p-PKR及p-e IF2α蛋白的相对表达量高于p EGFP-C1转染组和空白对照组(均P<0.05),p EGFP-C1转染组和空白对照组比较,差异无统计学意义;p EGFP-C1/p53转染组He La细胞增殖活性及侵袭能力均显著低于p EGFP-C1转染组和空白对照组(均P<0.05),p EGFP-C1转染组和空白对照组比较,差异无统计学意义。结论P53能上调PKR的表达及活性,激活PKR/e IF2α信号通路,抑制宫颈癌He La细胞增殖及侵袭。

eEF2K沉默联合丹参酮ⅡA磺酸钠协同抑制人肺腺癌细胞系A549增殖

目的探讨真核延伸因子2激酶(eEF2K)基因转染及丹参酮ⅡA磺酸钠(STS)对肺腺癌细胞系A549增殖、侵袭和迁移的影响及其机制。方法预实验筛选STS最佳作用浓度。将A549细胞分为siRNA-NC组(转染siRNA-NC)、siRNA-eEF2K组(转染siRNA-eEF2K)、siRNA-NC+STS组(转染siRNA-NC+10μg/mL STS)和siRNA-eEF2K+STS组(转染siRNA-eEF2K+10μg/mL STS)。CCK-8法、克隆形成实验、Transwell小室法、划痕实验和流式细胞测量术检测细胞存活率、克隆形成率、穿膜细胞数、迁移率和凋亡率;免疫印迹法(Western blot)检测蛋白激酶B(AKT)、磷酸化(p)-AKT、Ki67、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白表达。结果与siRNA-NC组比较,siRNA-eEF2K组、siRNA-NC+STS组和siRNA-eEF2K+STS组细胞存活率、克隆形成率、穿膜细胞数、迁移率和p-AKT、Ki67、MMP-2、Bcl-2蛋白均明显降低,细胞凋亡率明显升高(P<0.05),且siRNA-eEF2K+STS组中上述指标变化幅度最大。结论eEF2K沉默联合STS可协同抑制A549细胞增殖,其作用机制可能与抑制p-AKT、Ki67、MMP-2、Bcl-2蛋白表达有关。

持续氟铝联合暴露对子代大鼠骨组织蛋白激酶R样内质网激酶-酸化真核细胞起始因子2α-激活转录因子4信号通路的影响

目的了解妊娠期、哺乳期及成年前持续氟铝联合染毒对子代大鼠骨组织内蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-酸化真核细胞起始因子2α(e IF2α)-激活转录因子4(ATF4)信号通路的影响。方法将36只健康成年清洁级SD孕鼠随机分为9组,分别为对照(自来水)组和氟化钠(60、240 mg/L)组、氯化铝(600、1 000 mg/L)单独染毒组及氟化钠+氯化铝联合染毒组,每组4只。采用自由饮水方式染毒,母鼠从妊娠第0天至子代大鼠出生第21天(postnatal day 21,PND21)染毒;每组随机选取8只子代大鼠继续以同组剂量染毒至PND90。染毒结束后,收集大鼠骨组织,以qRT-PCR法检测骨组织中ATF4和e IF2α的mRNA表达水平,ELISA测定骨组织中p-PERK、ATF4蛋白含量。结果与对照组比较,除低铝、高氟+低铝联合染毒组外,其余各染毒组子代大鼠骨组织中p-PERK蛋白含量明显升高(P<0.05);低氟组和低氟+高铝联合染毒组的ATF4蛋白含量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。氟铝联合染毒对p-PERK蛋白含量的影响表现为拮抗型交互作用(P<0.05);ATF4蛋白含量除高氟+低铝联合染毒组表现为协同型交互作用外,其他联合染毒组均表现为拮抗型交互作用(P<0.05)。除低氟组大鼠骨组织中e IF2αmRNA的表达明显升高外,其余染毒组明显降低(P<0.05)。除高氟+低铝联合染毒组大鼠骨组织中ATF4的mRNA表达明显升高外,其余各染毒组明显降低(P<0.05)。单独高氟或高铝染毒组比单独的低氟或低铝染毒组ATF4 mRNA表达量高,差异有统计学意义(P<0.05)。氟铝联合染毒对e IF2α及ATF4 mRNA表达水平的影响存在拮抗型交互作用(P<0.05)。结论氟铝联合可通过亲代胎盘屏障、乳汁及子代大鼠自身摄入等途径进入子代大鼠体内,诱发骨细胞内质网应激,PERK-e IF2α-ATF4信号通路参与了氟铝联合持续暴露的子代大鼠骨损伤机制。

miR-26b-5p通过下调MKNK2/eIF4E信号通路抑制胰腺癌细胞的增殖及侵袭

目的:筛选胰腺癌(PC)侵袭相关微小RNA(miRNA,miR),验证其生物学功能和调控的信号通路,为胰腺癌的诊治提供新的分子标志物和靶点。方法:通过基因表达综合数据库(GEO)的miRNA表达谱数据集GSE71533和GSE85589,分析miR-26b-5p的差异表达;利用癌症基因组图谱数据库(TCGA),分析miR-26b-5p对PC患者总生存率的影响。采用TargetScan数据库识别miR-26b-5p的靶基因集。通过细胞功能实验,验证miR-26b-5p对PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭的影响。利用基因本体(GO)和KEGG通路富集分析,揭示miR-26b-5p靶基因的功能,并通过蛋白印迹(Western blotting)实验验证miR-26b-5p靶向的信号通路。结果:在GSE71533和GSE85589数据集,相对于正常组织和对照组血浆,miR-26b-5p在PC组织和PC患者血浆明显低表达(9.65±0.10 vs 10.18±0.07,P<0.001;0.67±0.18 vs 0.79±0.24,P=0.017)。TCGA-胰腺癌生存分析结果显示,miR-26b-5p高表达组的总体生存率明显优于低表达组(P=0.023)。KEGG分析显示,预测的251个miR-26b-5p的靶基因与MAPK信号通路有关。CCK-8实验、Transwell迁移、侵袭实验和划痕实验结果显示:miR-26b-5p抑制PANC-1细胞的增殖、迁移和侵袭。KEGG通路富集分析结果提示miR-26b-5p的靶基因参与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路。Western blotting实验证实miR-26b-5p下调MKNK2/eIF4E信号通路。结论:miR-26b-5p下调MKNK2/eIF4E信号通路,抑制PANC-1细胞增殖、侵袭,有可能作为胰腺癌诊断和治疗的新靶点。

人参皂甙Rbl对心力衰竭大鼠蛋白激酶R样内质网激酶途径的影响

目的探讨人参皂甙Rbl(Gs-Rb1)改善阿霉素所致心力衰竭(HF)效应是否与调整蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)通路有关。方法阿霉素(Adr)诱导的HF大鼠随机分为HF组(n=15)和Gs-Rbl组(70mg/kg/d,n=17),另随机选取同龄大鼠作为对照组(n=10)。干预结束并进行心脏超声检查后,TUNNEL检测心肌细胞凋亡率(AR),Western blot和Rt-PCR检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、PERK、p-PERK、真核细胞起始因子2α(eIF2α)、p-eIF2α、C/EBP同源蛋白(CHOP)和cleaved caspase-12。结果 1.Adr干预成功构建HF模型,Gs-Rb1显著提高左室射血分数(LVEF)和降低心肌细胞AR(P<0.01);2.HF组GRP78mRNA和蛋白均显著高于对照组,Gs-Rb1显著低于HF组和对照组二组的表达(P<0.01);3.Gs-Rb1显著降低HF大鼠PERK和p-PERK表达(P<0.01);4.HF导致eIF2αmRNA和蛋白、p-eIF2α显著升高,Gs-Rb1显著下调三者的表达(P<0.01);5.HF组CHOP mRNA和蛋白显著高于对照组,Gs-Rb1组显著抑制其表达(P<0.01);6.Gs-Rb1显著抑制阿霉素所致的caspase-12mRNA和cleaved caspase-12蛋白表达(P<0.01)。结论 Gs-Rb1通过调节PERK内质网通路介导其改善HF效应。

宫颈病变组织中PKR、p-PKR、p-EIF2α表达及意义

目的:探讨蛋白激酶R(PKR)→真核细胞翻译起始因子2α(EIF2α)信号传导通路中PKR、磷酸化型PKR、EIF2α(p-PKR、p-EIF2α)表达与宫颈病变的相关性、在宫颈肿瘤形成演进过程中的作用及对宫颈癌患者预后的影响。方法:采用免疫组化法检测PKR、p-PKR、p-EIF2α在63例宫颈癌、114例宫颈上皮内瘤样病变(CINⅠ～Ⅲ)、15例正常宫颈组织中的表达。结果:PKR在各组的阳性表达率随宫颈病变级别升高而升高,并与宫颈病变级别呈正相关(P<0.05);p-PKR、p-EIF2α在各组的阳性表达率随宫颈病变级别升高而先升高、后下降;在宫颈癌组,PKR的阳性表达率明显高于p-PKR(P<0.01);宫颈癌患者临床分期晚者病情进展快(P<0.01),p-PKR、p-EIF2α阴性表达者病情进展快(P<0.05)。结论:PKR的表达与宫颈病变级别相关;在宫颈高级别病变中存在PKR、EIF2α磷酸化障碍或p-PKR、p-EIF2α去磷酸化机制,使宫颈病变进展,可能导致宫颈癌患者预后不良。

新型的eEF2K抑制剂BL-EKI03在乳腺癌中诱导自噬和凋亡作用机制研究

目的真核延伸因子-2激酶(e EF2K)可以使癌细胞适应代谢压力,在一些癌症类型中发现了e EF2K的高表达,e EF2K有助于癌症的发生,可作为一个潜在的治疗靶点,然而抑制e EF2K的抗肿瘤药物的开发依然停留在初期。方法通过同源建模,分子对接及动力学模拟,等离子共振分析,化学合成,MTT细胞活性筛选候选药物;通过荧光染色,流式细胞术,免疫印迹及si RNA转染等验证相关机制。结果经过一系列靶向e EF2K的候选药物筛选,最终找到了一个新的与e EF2K有良好亲和力的e EF2K抑制剂(BL-EKI03)。在MCF-7,MDA-MB-436细胞中,我们发现BL-EKI03有显著的抗增殖活性,并且可以诱导细胞自噬和细胞凋亡。更重要的是,我们验证了BL-EKI03通过e EF2K介导的AMPKm TOR-ULK复合体通路来诱导死亡性自噬的机制。结论一个新型的e EF2K抑制剂(BL-EKI03)通过诱导自噬和凋亡发挥抗乳腺癌作用,为肿瘤治疗提供了新希望。

eEF2K在癫痫突触可塑性的研究进展

癫痫是以神经元异常兴奋为特征的神经系统疾病之一,癫痫发生时可引起突触可塑性的失调从而导致了学习和记忆能力减弱,这一过程与蛋白质从头合成有关。真核细胞延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor 2kinase,eEF2K)作为一种钙/钙调蛋白依赖性激酶,通过磷酸化其唯一底物真核细胞延伸因子2(eukaryotic elongation factor 2,eEF2)来调控蛋白的翻译延伸。eEF2/eEF2K磷酸化/去磷酸化动态过程起着调节蛋白质合成、突触可塑性和记忆巩固等作用。eEF2K活性受一系列调控信号严密调控,包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin1,mTOR)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)等,但作用机制知之甚少。本文主要对eEF2/eEF2K在癫痫突触可塑性作用机制作一综述,以期为癫痫及记忆衰退的未来诊疗提供新的思路。

eEF2K蛋白同源模建及其抑制剂小分子的虚拟筛选研究

目的:筛选潜在的真核生物延伸因子2激酶(eEF2K)抑制剂小分子,为eEF2K抑制剂的设计和研发提供参考。方法:采用同源模建技术构建eEF2K蛋白晶体结构模型,并进行Loop优化和分子动力学优化,借助SAVES在线服务器从Verify3D、EERAT和拉氏图等3个方面对上述模型进行评估。收集55个eEF2K抑制剂小分子,使用InsightⅡ软件以其中的28个(编号为奇数,设为训练集)为基础构建具有活性预测能力的Hypogen药效团模型,以另外27个(编号为偶数,设为测试集)进行验证,通过拟合活性[即半数抑制浓度的负对数(p IC50)]预测值与真实值并借助Ligand profiler热图筛选最优药效团模型。结合上述药效团模型和Lipinski五规则、分子对接方法进行eEF2K抑制剂小分子的虚拟筛选。结果与结论:所建eEF2K蛋白晶体结构模型的整体质量因素得分为93.697,其中83.33%的氨基酸Verify3D得分≥0.2,且位于不允许区的氨基酸占氨基酸总数的1.7%,其氨基酸构象及骨架结构合理,模型可靠性高。共构建了9个具有活性预测功能的Hypogen药效团模型(02~10号),其中03号药效团模型包含2个氢键受体和2个共轭芳香环,可更好地区分活性及非活性分子,其pIC50预测值与真实值拟合最好(相关系数为0.665 3),具有较好的预测能力和较高的可靠性。通过虚拟筛选最终获得9个潜在的eEF2K抑制剂小分子(pIC50预测值为1.074~1.185,分子与蛋白相互作用的Dcoking-score得分为-9.730^-7.467),其中Pro268、Asp267、Gln171、Phe121、Glu212可能是e EF2K抑制剂与靶点蛋白相互作用的关键氨基酸,作用方式包括氢键、盐桥、疏水等。上述分子有望成为e EF2K抑制剂研发的先导化合物。

早期糖尿病视网膜病变中eEF2K活性变化的实验观察

目的观察早期糖尿病大鼠视网膜中真核生物延伸因子2激酶(e EF2K)的变化,探讨e EF2K活性变化在早期糖尿病视网膜病变(DR)中的意义。方法建立SD大鼠链脲佐菌素(STZ)糖尿病高血糖模型,造模成功后,设立糖尿病大鼠(DM)组和正常对照(NC)组。qRT-PCR检测DM组和NC组4周和8周时大鼠神经视网膜中e EF2K的表达情况。免疫荧光法观察定位神经视网膜中e EF2K激活标志物-磷酸化真核生物延伸因子2(p-eEF2)和Müller细胞活化标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达情况。结果 4周和8周时DM组大鼠神经视网膜中e EF2K的表达水平与NC组相比无明显变化。8周时DM组大鼠神经视网膜各层均出现e EF2K激活表现,即p-eEF2表达增强。神经节细胞层出现细胞凋亡样改变,凋亡样神经节细胞中e EF2的磷酸化水平增强最为明显。神经视网膜中Müller细胞活化,GFAP蛋白表达增强。结论 STZ诱导糖尿病大鼠早期视网膜病变中神经视网膜内e EF2K激活,在凋亡样神经节细胞中e EF2K活性上升最为显著。

微小RNA-22调控人动脉平滑肌细胞增殖、迁移和凋亡功能及其机制

目的探讨微小RNA（miRNA，miR）-22是否参与调控人动脉平滑肌细胞（ASMCs）功能及其机制。方法实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—-PCR）和荧光原位杂交观察miR-22在动脉壁中的表达特点；细胞计数试剂盒（CCK-8）法、迁移小室（Transwell）及流式细胞实验分别检测miR-22对ASMCs增殖、迁移及凋亡的影响；双荧光素酶基因报告实验确定miR-22的靶基因；通过慢病毒过表达miR-22后，观察其对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的影响。结果（1）miR-22在动脉硬化闭塞症（ASO）血管壁中表达（0．256±O．046）明显低于正常血管壁（0．946±0．081，P=0．000），且其主要定位于动脉中层；（2）与对照组比较，miR-22具有抑制ASMCs增殖（1．146±0．050比1．677±0．082，P=0．000）和迁移（16．50±1．38比37．83±2．54，P=0．000），促进凋亡的功能[（7．33±0．98）％比（3．95±0．89）％，P=0．000]。（3）双荧光素酶基因报告实验证实真核生物延伸因子2激酶（eEF2K）是miR-22的靶基因，miR-22可在转录后水平负性调控eEF2K表达；（4）慢病毒（LV）-miR-22组（0．832±0．126）与对照组（1．579±0．215，P=0．000）比较，明显减少大鼠颈动脉新生内膜面积。结论miR-22通过靶向结合eEF2K，抑制ASMCs增殖及迁移、促进凋亡，减少新生内膜增生。

虎杖苷通过内质网应激相关通路对阿霉素肾病模型大鼠肾脏及心脏的保护作用

目的探讨虎杖苷通过内质网应激相关通路对阿霉素肾病模型大鼠肾脏及心脏的保护作用。方法将40只SD雄性大鼠随机分为模型组、虎杖苷组、联合组、对照组,各10只。除对照组外,给予其他3组大鼠建立阿霉素肾病大鼠模型。建模成功后,给予联合组灌胃100 mg/kg虎杖苷及腹腔注射含CCT020312[蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/真核细胞起始因子2α(eIF2α)/CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)通路激活剂]的二甲基亚砜(DMSO),给予虎杖苷组灌胃100 mg/kg虎杖苷及腹腔注射DMSO;给予对照组、模型组灌胃生理盐水及腹腔注射DMSO,均1次/d,共干预7周。观察各组大鼠肾脏及心脏的病理变化。检测各组大鼠的心脏功能指标[左室等容舒张时间(IVRT)、二尖瓣舒张早期峰值速度(E)、舒张晚期峰值速度(A)]、肾功能指标(24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐),以及肾脏组织PERK、磷酸化PERK(p-PERK)、eIF2α、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)、CHOP蛋白表达量。结果(1)模型组大鼠的肾小球肥大变形、增生现象严重、组织结构被破坏,膜外基质增多,血管塌陷,间质存在大量炎性细胞浸润,肾小管萎缩;心肌细胞肿胀变形、排列松散混乱、组织结构被破坏,部分心肌纤维断裂消失,可见大量炎性细胞浸润。虎杖苷组与联合组大鼠上述病理改变均较模型组改善,且虎杖苷组的改善更明显。(2)与对照组比较,模型组的24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平,二尖瓣A值,以及肾脏组织CHOP蛋白表达量、p-PERK/PERK比值、p-eIF2α/eIF2α比值均升高,IVRT延长,二尖瓣E值降低(均P<0.05);与模型组比较,虎杖苷组与联合组的24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平,二尖瓣A值,以及肾脏组织CHOP蛋白表达量、p-PERK/PERK比值、p-eIF2α/eIF2α比值均降低,IVRT均缩短,二尖瓣E值均升高,且虎杖苷组上述指标改善均优于联合组(均P<0.05)。结论虎杖苷可保护阿霉素肾病模型大鼠的肾脏及心脏功能,其作用机制可能与抑制PERK/eIF2α/CHOP信号通路有关。

微量胰岛素对七氟醚吸入麻醉诱导新生大鼠认知功能障碍的预防作用及其可能的作用机制

目的探讨微量胰岛素对七氟醚吸入麻醉诱导大鼠认知功能障碍的预防作用,及其可能的作用机制。方法将60只新生大鼠随机分为对照组(CON)、低剂量胰岛素预防组(LIP)、高剂量胰岛素预防组(HIP)和七氟醚模型组(MOD),其中预防组和模型组均采用七氟醚诱导构建大鼠认知功能障碍模型。采用Morris水迷宫定向航行实验和空间探索实验评价大鼠的学习和记忆功能;HE染色观察大鼠海马组织病理学变化;流式细胞术检测大鼠海马组织细胞的凋亡情况;RT-PCR检测海马组织雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、真核细胞肽链延伸因子2(eEF-2)mRNA表达水平;Western blotting检测脑源性神经营养因子(BDNF)、突触后致密蛋白-95 (PSD-95)、突触素-Ⅰ(synapsin-Ⅰ)、钙调蛋白激酶Ⅱα(Ca MKⅡα)、mTOR及eEF-2蛋白表达水平。结果 Morris水迷宫实验结果显示,胰岛素能够显著缩短大鼠逃避潜伏期时间及游泳距离,提高穿越平台次数;流式细胞术结果表明,胰岛素预防组能够显著抑制大鼠脑神经细胞的凋亡,且高剂量胰岛素预防组抑制效果更为明显;RT-PCR及Western blotting检测发现,模型组大鼠海马组织中mTOR、eEF-2 mRNA和蛋白表达水平显著升高,而BDNF、PSD-95、synapsin-Ⅰ、Ca MKⅡα蛋白表达水平显著降低;与模型组相比,胰岛素预防给药组大鼠海马组织中mTOR、eEF2 mRNA和蛋白表达水平显著下调,而BDNF、PSD-95、synapsin-Ⅰ、Ca MKⅡα蛋白表达水平明显上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论微量胰岛素可增加认知功能障碍大鼠海马组织中突触相关蛋白的表达,降低其mTOR、eEF-2 mRNA表达水平,预防七氟醚诱导的大鼠认知功能的障碍,其机制可能与调节mTOR-eEF2途径有关。

牛磺熊去氧胆酸对DSS诱导大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用及可能机制

目的:探究牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)对DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用及可能机制。方法:选取健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,随机分为正常组、模型组、治疗组,每组10只。模型组和治疗组给予葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium,DSS)诱导大鼠溃疡性结肠炎模型。正常组和模型组给予生理盐水灌胃,治疗组给予TUDCA灌胃,治疗7 d后处死大鼠,观察大鼠的一般情况及结肠组织病理改变。比较三组DAI、HI评分。Western blot检测大鼠结肠组织GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平。结果:治疗组大鼠一般情况及结肠组织病理情况均优于模型组。模型组、治疗组DAI评分均明显高于正常组(P<0.05),而治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组HI评分均明显高于正常组(P<0.05),而治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组结肠组织GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平均明显高于正常组(P<0.05),而治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TUDCA对DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎具有治疗作用,其机制可能是通过抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路发挥分子生物学作用。

GSK3β/eEF2K信号通过调控自噬参与肺成纤维细胞诱导分化

目的探讨糖原合成酶激酶3β(GSK3β)/真核延伸因子2激酶(eEF2K)在肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞过程中的表达,以及对细胞自噬和纤维化的影响。方法将L-929细胞(对照组)于适宜条件下培养48 h,加入5 ng/mL TGF-β1诱导其表型转化为肌成纤维细胞(TGF-β1组)。将空质粒、si-eEF2K及si-GSK3β转染肌成纤维细胞,培养48 h后采用免疫荧光染色法检测p-eEF2K和α-SMA蛋白表达情况,蛋白质印迹法检测各组eEF2K、p-eEF2K、GSK3β、P62及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达情况。结果与对照组相比,TGF-β1组细胞p-eEF2K、GSK3β蛋白和α-SMA蛋白表达显著增加(P<0.05);转染si-eEF2K及si-GSK3β后,L-929细胞p-eEF2K/eEF2K表达下降(P<0.05),P62和LC3-Ⅱ/Ⅰ表达水平增加(P<0.05),α-SMA蛋白表达降低(P<0.05)。结论GSK3β/eEF2K信号可能通过降低自噬活性促进肺成纤维细胞向肌纤维细胞的表型转化,促进细胞纤维化进程。