真核翻译延长因子1A2对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长和血管形成作用的研究

背景:人类真核翻译延伸因子1A2(EEF1A2)是一种管家基因,可能作为一种新的潜在癌基因,参与肿瘤的发生、发展。目的:探讨EEF1A2对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长和血管形成的作用。方法:以聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因片段,应用基因重组技术构建Ad5/F35-EEF1A2重组腺病毒载体。15只裸鼠建立人胰腺癌移植瘤模型,随机分为对照组、绿色荧光蛋白(GFP)组和EEF1A2组,分别注射PBS0.1ml、Ad5/F35-GFP0.1ml(1×108PFU)和Ad5/F35-EEF1A20.1ml(1×108PFU)。测定各组肿瘤体积和质量,应用免疫组化方法检测各组增殖细胞核抗原(PCNA)和CD31的表达。结果:成功构建了表达EEF1A2的重组腺病毒载体。与对照组和GFP组相比,EEF1A2组裸鼠肿瘤体积和质量显著增加(P<0.05),PCNA和CD31表达显著增高(P<0.05)。结论:EEF1A2可显著促进人胰腺癌裸鼠移植瘤生长,细胞增殖和肿瘤血管形成可能是其重要作用机制。

siRNA抑制真核翻译延长因子1A1表达对结肠癌细胞凋亡和药物敏感性的影响

目的研究特异性siRNA抑制结肠癌细胞HCT-116真核翻译延长因子1A1(e EF1A1)基因及其对结肠癌细胞HCT-116凋亡和药物敏感性的影响。方法设计针对人源结肠癌细胞HCT-116 e EF1A1基因的siRNA,转染至对数生长期的结肠癌细胞HCT-116,分别用反转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹法鉴定e EF1A1基因沉默的效果,用流式细胞仪检测e EF1A1基因表达抑制对结肠癌细胞HCT-116凋亡的影响,用噻唑蓝法(MTT)检测e EF1A1基因表达抑制后结肠癌细胞HCT-116药物敏感性的变化。结果 e EF1A1靶向siRNA能显著降低结肠癌细胞HCT-116中e EF1A1的表达,e EF1A1表达抑制后结肠癌细胞HCT-116的增值能力显著低于对照组(P<0.05),5-氟尿嘧啶和顺铂对e EF1A1表达抑制的结肠癌细胞HCT-116的半抑制浓度显著低于对照组(P<0.05)。结论 e EF1A1靶向siRNA能有效抑制e EF1A1基因表达,并能协同增强5-氟尿嘧啶和顺铂对结肠癌细胞HCT-116的杀伤作用和诱导凋亡作用。

二羟环氧苯并芘诱导转化与翻译延长因子的关系

目的探讨真核翻译延长因子1α1(eTEF1α1)基因在反式二羟环氧苯并芘致癌机制中所起的作用。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增真核翻译延长因子1α1基因全长,插入pcDNATM3.1 D irectional TOPO表达载体,以脂质体转染介导的技术和G418细胞筛选法转染人支气管上皮细胞,构建转基因稳定表达的细胞株。用半定量RT-PCR方法分析转基因表达产物,对转基因细胞株,进行双层软琼脂试验以确定基因的恶性特性。结果成功扩增出eTEF1α1基因全长,构建出稳定表达真核翻译延长因子1α1基因的细胞株。稳定转染eTEF1α1基因的细胞株,能在双层软琼脂中形成克隆。结论真核翻译延长因子1α1基因与反式二羟环氧苯并芘的恶性转化有关。

eEF1A1通过HGF/c-MET通路调控肝癌细胞的迁移和侵袭能力

目的探讨真核翻译延长因子1A1(eukaryotic translation elongation factor 1α1,eEF1A1)对肝癌细胞的侵袭、迁移和HGF/c-MET通路的影响及作用机制。方法采用qRT-PCR和Western bolt检测肝癌细胞和组织中eEF1A1表达。构建eEF1A1敲除载体转染HLF和Alex肝癌细胞,CCK-8和Transwell实验检测细胞的增殖、侵袭和迁移能力。KM plotter分析患者的总体预后。通过eEF1A1基因敲除的转录组测序,Western bolt检测HGF、c-MET和p-c-MET蛋白的表达。裸鼠皮下成瘤实验检测eEF1A1对肝癌肿瘤的影响。结果eEF1A1在肝癌细胞和组织中显著升高,敲低eEF1A1能抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭。eEF1A1高表达与肝癌的不良预后相关。此外,敲除eEF1A1显著降低HGF和p-c-MET蛋白水平,抑制肝癌肿瘤的生长,但c-MET蛋白水平无显著差异。结论eEF1A1通过抑制HGF/c-MET信号通路抑制肝癌细胞迁移和侵袭。

eEF1A1基因敲除对Jurkat细胞增殖和凋亡的影响及其机制探讨

本研究旨在探讨真核翻译延长因子1A1(eEF1A1)表达沉默对人急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞株Jurkat增殖、凋亡的影响及其作用机制。应用实时PCR法和Western blot法分别检测Jurkat细胞和3例健康成人外周血单个核细胞(PBMNC)中eEF1A1 mRNA和蛋白的表达。构建eEF1A1-shRNA慢病毒并感染Jurkat细胞,另设空白和阴性对照组,应用实时PCR法和Western blot法分别检测细胞eEF1A1 mRNA和蛋白的表达;应用MTT法、AnnexinⅤ-APC标记法、DNA倍体法分别检测细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期,Western blot法检测细胞PI3K/Akt信号通路相关信号分子的表达。结果表明,Jurkat细胞eEF1A1 mRNA和蛋白的表达水平明显高于健康成人PBMNC中的表达(P<0.01,P<0.05);构建的eEF1A1-shRNA慢病毒高效沉默Jurkat细胞eEF1A1的表达。与阴性对照组相比,eEF1A1-shRNA组Jurkat细胞增殖能力明显下降,凋亡明显增多,细胞周期被阻滞于G0/G1期,p-Akt、NF-κB、p-NF-κB、mTOR、p-mTOR蛋白的表达明显下调。结论:eEF1A1在T-ALL细胞中可能具有潜在的致癌作用,其表达沉默可有效抑制Jurkat细胞的增殖并诱导凋亡,其机制可能与下调PI3K/Akt/NF-κB和PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

eEF1A2在原发性肝细胞癌的表达

目的:研究真核翻译延长因子1A2(e EF1A2)在原发性肝细胞癌(HCC)组织的表达,以及e EF1A2过表达对HCC细胞生物学行为的影响。方法:应用real-time PCR法和免疫组化法分别检测62例HCC癌组织与配对癌旁组织、20例正常肝脏组织e EF1A2的mRNA和蛋白表达,应用real-time PCR法与Western blot法分别检测几种HCC细胞株e EF1A2的mRNA与蛋白表达。构建GV287-e EF1A2表达慢病毒感染低表达e EF1A2的HCC细胞,应用real-time PCR法和Western blot法分别检测细胞e EF1A2的mRNA和蛋白表达;应用MTT法、DNA倍体法和real-time PCR法分别检测细胞活力、细胞周期和白蛋白mRNA的表达。结果:HCC癌组织e EF1A2的mRNA表达水平和蛋白表达阳性率明显高于配对癌旁组织与正常肝脏组织(P<0.01);e EF1A2的mRNA和蛋白在HCC细胞株SMMC-7721和BEL-7402高表达,在SK-HEP-1低表达。构建的GV287-e EF1A2表达慢病毒可感染SK-HEP-1细胞使e EF1A2过表达;与阴性对照组相比,GV287-e EF1A2组SK-HEP-1细胞的活力升高,白蛋白的mRNA表达水平降低,G0/G1期的细胞比例显著减少,而S期和G2/M期的细胞比例显著升高。结论:e EF1A2在HCC癌组织存在异位高表达;e EF1A2可能是HCC的一种潜在癌蛋白,其过表达可增强HCC细胞的增殖能力,降低HCC细胞的分化程度,并促使细胞周期通过G0/G1期,进入S期和G2/M期。

eEF1A2基因沉默的原发性肝细胞癌BEL-7402细胞株的建立

目的本研究旨在构建针对高表达真核翻译延长因子1A2(eEF1A2)的原发性肝细胞癌(HCC)BEL-7402细胞株的eEF1A2-RNAi的细胞模型,为从基因沉默基因敲除层面研究eEF1A2在HCC潜在的致癌作用的功能奠定实验基础。方法通过针对eEF1A2基因的shRNA与线性化的GV115-GFP载体进行连接转化,对获得的重组子(GV115-GFP-eEF1A2-shRNA)进行PCR和测序鉴定。采用慢病毒载体系统将pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体与GV115-GFP-eEF1A2-shRNA共转染293T细胞,包装成eEF1A2-RNAi-LV,并感染高表达eEF1A2的BEL-7402细胞。采用Real time PCR和Western blot法分别从mRNA和蛋白水平验证eEF1A2-RNAi-LV对BEL-7402细胞eEF1A2表达的抑制作用。结果成功构建了重组真核表达载体GV115-GFP-eEF1A2-shRNA,并通过慢病毒载体系统包装成eEF1A2-RNAi-LV;将eEF1A2-RNAi-LV转染至BEL-7402细胞后,细胞eEF1A2 mRNA和蛋白的表达水平分别下降了84.1%和64.5%,与阴性对照组相比较具显著性差异(P<0.01),表明转染后的BEL-7402细胞eEF1A2基因被特异性沉默。结论成功构建了eEF1A2-RNAi的BEL-7402细胞模型,为进一步从基因敲除层面研究eEF1A2在HCC潜在的致癌作用奠定了良好的实验基础。