真核翻译起始因子4E结合蛋白1

真核翻译起始因子4E结合蛋白1（e IF4E-binding protein 1,4E-BP1）是一种高度保守的小分子蛋白,在蛋白翻译起始途径选择中发挥重要的功能。4E-BP1通过与脚手架蛋白e IF4G竞争性结合转录起始因子e IF4E,抑制e IF4E的功能及帽依赖性蛋白质翻译起始。4E-BP1受PI3K/AKT/mT OR、MEK/ERK/MAPK等多种信号通路的调节,4E-BP1发生磷酸化修饰后与e IF4E解离。除负调控蛋白翻译起始功能外,4E-BP1还通过调节cyclin D1的翻译、与PLK1相互作用等,从而影响细胞周期进程。

真核翻译起始因子4γ2调控N-乙酰氨基半乳糖转移酶1 mRNA对胃癌细胞恶性表型的影响

目的探讨真核翻译起始因子4γ2(EIF4G2)通过调控N-乙酰氨基半乳糖转移酶1(GALNT1)mRNA对胃癌进展的影响。方法通过生物信息数据库分析GALNT1、EIF4G2在胃癌细胞和胃癌组织中的表达及与胃癌患者预后的关系,并分析胃癌组织中EIF4G2、GALNT1表达的相关性。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测GALNT1 mRNA、EIF4G2 mRNA在人胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌细胞(AGS细胞等)中的表达水平,并采用蛋白质印迹法(Western blot)检测GALNT1、EIF4G2蛋白表达水平。建立干扰GALNT1和过表达EIF4G2的AGS细胞株,采用CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖能力,采用TUNEL实验检测细胞凋亡能力,采用划痕实验和Transwell实验分别检测细胞迁移和侵袭能力,采用Western blot检测凋亡和转移相关蛋白表达水平,采用RIP实验和RNA下拉实验检测GALNT1 mRNA与EIF4G2的结合关系。结果胃癌组织和胃癌细胞中的GALNT1、EIF4G2水平分别高于正常组织和人胃黏膜上皮细胞,差异有统计学意义(P<0.001),且与胃癌患者预后差相关;胃癌组织中,EIF4G2表达与GALNT1表达呈正相关。敲低GALNT1后,AGS细胞活力降低,克隆形成数、迁移和侵袭细胞数减少,凋亡细胞数增加,Bcl-2、MMP2、MMP9蛋白表达降低,Bax、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.001)。EIF4G2可与GALNT1 mRNA结合,促进GALNT1 mRNA、GALNT1蛋白表达及GALNT1 mRNA稳定性,差异有统计学意义(P<0.001)。共转染sh-GALNT1-1与oe-EIF4G2可逆转sh-GALNT1-1对AGS细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。结论EIF4G2可通过稳定GALNT1 mRNA促进胃癌细胞增殖、迁移、侵袭并抑制细胞凋亡,其或可成为胃癌临床诊疗的新靶点。

eIF4E与磷酸化eIF4E结合蛋白1在甲状腺乳头状癌中的表达及意义

目的观察真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)及磷酸化eIF4E结合蛋白1(p-4EBP1)在甲状腺乳头状癌组织中的表达,并探讨其与甲状腺乳头状癌的侵袭、转移等临床病理特征间的关系。方法采用免疫组化EnVinsion法检测66例乳头状癌(经典型乳头状癌37例,滤泡型乳头状癌29例)、20例结节性甲状腺肿伴乳头状增生及上述病例的肿瘤旁正常甲状腺组织中eIF4E与p-4EBP1的表达。结果在肿瘤旁正常甲状腺组织、甲状腺肿伴乳头状增生及乳头状癌中,eIF4E的阳性率分别为11.6%(10/86)、50.0%(10/20)和84.8%(56/66)(P<0.01);p-4EBP1的阳性率分别为8.1%(7/86)、40.0%(8/20)和66.7%(44/66)(P<0.01),并且p-4EBP1在滤泡型乳头状癌中的表达显著高于其在经典型乳头状癌中的表达(P<0.01)。eIF4E在有腺外侵袭和淋巴结转移的病例中的阳性率分别为96.7%(29/30)和100.0%(29/29),分别高于无腺外侵袭和无淋巴结转移的病例,后者阳性率分别为75.0%(27/36)和73.0%(27/37)(P<0.05)。而p-4EBP1在这两组病例中的表达差异则无显著性意义(P>0.05)。结论和正常甲状腺及甲状腺良性病变相比,eIF4E和p-4EBP1在乳头状癌中存在过表达;eIF4E的过表达与乳头状癌的侵袭与转移关系密切,在乳头状癌的进展中可能发挥了重要作用。

结直肠癌组织中S6K1及4EBP1蛋白的表达及其与临床病理特征的关系

目的:探讨结直肠癌组织中S6蛋白激酶1(protein S6 kinase 1,S6K1)和真核翻译起始因子-4E结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,4EBP1)的表达情况及其与结直肠癌患者临床病理参数之间的关系。方法:收集济南军区总医院肿瘤科2007年1月至2009年12月收治的有完整临床病理资料、经手术切除的100例结直肠癌组织与40例正常癌旁结直肠黏膜组织、30例淋巴结转移灶组织、15例远处转移灶组织,用免疫组化方法检测上述组织中S6K1和4EBP1蛋白的表达,并分析其与患者临床病理参数之间的关系。结果:S6K1和4EBP1蛋白在正常结直肠黏膜组织中的阳性表达率分别为17.50%(7/40)和22.50%(9/40),而在结直肠癌组织中的阳性表达率分别为74.00%(74/100)和79.00%(79/100),S6K1和4EBP1蛋白在癌和正常结直肠黏膜组织中的阳性表达率间差异均有统计学意义(P<0.01);在结直肠癌组织中,S6K1蛋白的阳性表达与结直肠癌患者的临床分期(r=0.31,P<0.01)及组织分化程度(r=0.25,P<0.05)显著相关。4EBP1蛋白的阳性表达与结直肠癌患者的临床分期(r=0.27,P<0.01)及组织分化程度(r=0.22,P<0.05)显著相关。S6K1和4EBP1蛋白高表达患者无疾病进展时间(progression free survival,PFS)更短(P<0.05),但S6K1和4EBP1蛋白表达水平对患者的总生存期(overall survival,OS)无影响(P>0.05)。S6K1和4EBP1蛋白两者的阳性表达呈正相关(r=0.25,P<0.05)。结论:S6K1及4EBP1蛋白在结直肠癌形成过程中有互相促进作用,与结直肠癌的发生发展及预后相关,可作为较为理想的分子靶点和预后评估指标。

电针对创伤性颅脑损伤大鼠脑组织中p-4E-BP1及VEGF蛋白表达的影响

目的:观察电针对颅脑损伤(TBI)大鼠神经功能、脑组织中真核起始因子4E结合蛋白1和血管内皮生长因子(p-4E-BP1/VEGF)蛋白表达的影响,探讨电针在TBI治疗中的可能机制。方法:SPF级SD大鼠随机分组纳入假手术组与空白组各8只、模型组与电针组各24只。模型组与电针组使用Feeney自由落体颅脑打击装置制备TBI大鼠模型;假手术组只开颅不打击,空白组不做处理。分别于造模后24 h、3 d、7 d和14 d再次进行mNSS评分以评价各组大鼠神经功能缺损程度。电针组于模型制备后24 h电针针刺患侧“足三里”“内关”“百会”“水沟”穴,采用断续波,2 Hz,1次/d,15 min/次,连续治疗14 d。在造模后的3 d、7 d和14 d分批次对模型组、电针组大鼠脑组织取材,空白组和假手术组在造模后14 d一并取材。采用免疫组化法和免疫印迹法观察大鼠脑组织中p-4E-BP1及VEGF的蛋白表达情况。结果:造模后3 d、7 d和14 d电针组、模型组mNSS评分呈下降趋势,同时间点电针组mNSS评分下降幅度较模型组大(P<0.01)。p-4E-BP1及VEGF蛋白在空白组和假手术组大鼠脑组织中均有少量表达,两组差异无统计学意义(P>0.05);经电针干预后,各时间点电针组大鼠脑组织中p-4E-BP1和VEGF蛋白表达量均高于模型组(P<0.05);同时间点模型组、电针组大鼠与空白组、假手术组大鼠比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:电针能促进TBI大鼠脑组织中p-4E-BP1及VEGF蛋白的表达,改善TBI大鼠神经功能缺损症状,这可能是电针保护脑神经功能、减轻脑细胞自噬的部分机制之一。

C-myb蛋白、4E-BP1蛋白在NK/T细胞淋巴瘤中的表达与预后的关系

目的探讨转录激活因子Myb(C-myb)、真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白-1(4E-BP1)蛋白在NK/T细胞淋巴瘤中的表达及与预后的关系。方法回顾性选取2017年12月至2019年12月在秦皇岛市第一医院治疗的NK/T细胞淋巴瘤患者34例作为观察组,同时选取腺样体肥大组织30例作为对照组。采用免疫组织化学法检测C-myb、4E-BP1表达,比较两组患者C-myb、4E-BP1表达情况,分析观察组C-myb、4E-BP1表达与临床病理关系。采用Spearman秩相关分析C-myb和4E-BP1表达相关性。随访患者总体生存时间,分析C-myb、4E-BP1表达与预后的关系。结果观察组C-myb和4E-BP1阳性表达率分别为55.88%和61.76%,明显高于对照组(10.00%、6.67%),差异均有统计学意义(P<0.05)。临床分期Ⅲ~Ⅳ患者C-myb阳性表达率为91.67%,明显高于Ⅰ~Ⅱ患者(36.36%),差异有统计学意义(P<0.05);不同性别、年龄、原发部位、B症状、国际预后指数(IPI)指数及淋巴结侵犯患者C-myb阳性表达率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。IPI指数≤2分患者4E-BP1阳性表达率为76.00%,明显高于IPI指数>2分患者(22.22%),差异有统计学意义(P<0.05);不同性别、年龄、原发部位、B症状、临床分期及淋巴结侵犯患者4E-BP1阳性表达率比较,差异均无统计学意义(P>0.05);C-myb和4E-BP1表达呈正相关(r_(s)=0.642,P<0.05);C-myb阳性表达和阴性表达患者中位总生存时间比较,差异无统计学意义(P>0.05);4E-BP1阳性表达患者中位总生存时间为24个月(95%CI:21.15~26.85),明显短于4E-BP1阴性表达患者的33个月(95%CI:32.20~33.80),差异有统计学意义(P<0.05)。结论NK/T细胞淋巴瘤中C-myb和4E-BP1蛋白表达上调,与临床分期、IPI指数有一定关系,其中4E-BP1表达与患者预后可能有一定联系。

鼻咽癌组织p-eIF4E和p-4EBP1高表达与预后不良正相关

目的探讨磷酸化的真核细胞翻译起始因子4E(p-eIF4E)和磷酸化的eIF4E结合蛋白1(p-4EBP1)与鼻咽癌(NPC)临床病理特征和预后的相关性。方法免疫组织化学染色法检测314例NPC组织中p-eIF4E和p-4EBP1蛋白表达,利用SPSS16.0软件分析p-eIF4E和p-4EBP1蛋白表达与NPC临床病理特征及预后的相关性。结果 NPC组织中存在p-eIF4E和p-4EBP1蛋白异常高表达,阳性表达率分别为74.2%(233/314)、72.9%(229/314);p-eIF4E和p-4EBP1蛋白表达在淋巴结转移NPC组织中阳性表达率显著高于无淋巴结转移NPC组织,但与性别、年龄、临床分期和组织类型无关;NPC组织中p-eIF4E与p-4EBP1蛋白表达呈正相关,且p-eIF4E和p-4EBP1蛋白阳性的NPC患者生存时间明显短于p-eIF4E和p-4EBP1阴性患者,是NPC判断预后的独立因素。结论 p-eIF4E和p-4EBP1蛋白过表达可能与NPC的发生、发展及不良预后密切相关,p-eIF4E和p-4EBP1有望成为NPC临床诊治和判断预后的分子标志物。

4E-BP1在人脑胶质瘤细胞对卡氮芥获得性耐药中的作用

目的:探讨真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)与人脑胶质瘤细胞耐药性的关系,为寻找克服胶质瘤获得性耐药的新靶点提供理论依据。方法:Western blotting检测SWOZ2及其获得性耐药细胞株SWOZ2-BCNU中4E-BP1及其磷酸化蛋白(p-4E-BP1)的表达。小干扰RNA下调4E-BP1表达后,细胞计数试剂盒8检测SWOZ2细胞对卡氮芥(BCNU)的耐药性。免疫荧光法检测4E-BP1及p-4E-BP1(T70)蛋白在2株细胞中的表达位置。结果:SWOZ2-BCNU细胞中4E-BP1及其磷酸化蛋白表达较SWOZ2细胞明显下降。下调4E-BP1表达能明显增加敏感细胞对BCNU的耐药性。SWOZ2-BCNU细胞p-4E-BP1(T70)蛋白在获得性耐药过程中出现了核转位。结论:4E-BP1作为翻译调控关键蛋白,可能参与了人脑胶质瘤获得性耐药的发生机制。

食管癌组织中p-4EBP1、p-S6K1表达及意义

目的探讨p-4EBP1和p-S6K1在食管癌发生、发展中的作用。方法采用免疫组化SP法检测45份食管癌组织及20份正常食管组织中p-4EBP1及p-S6K1表达。结果食管癌组织中p-4EBP1和p-S6K1表达阳性率分别为71.1%和66.7%,正常食管组织中阳性率分别为25.0%和35.0%,P均<0.05;二者在食管癌组织中的表达呈正相关P<0.05(r=0.381)。结论 p-4EBP1和p-S6K1在食管癌发生、发展中起促进作用;二者可作为食管癌诊断、靶向治疗及预后判断的重要生物学标记物。

AEG-1调控eIF4E表达促进胃癌细胞迁移的作用机制

目的:探讨AEG-1调控e IF4E表达促进胃癌细胞迁移的作用机制。方法:在SGC7901胃癌细胞株上用质粒转染或siRNA转染的方法过表达或沉默AEG-1的表达,用Western blotting法检测eIF4E及上皮-间质样转化(EMT)的标志物表达的变化,用transwell实验检测胃癌细胞的迁移。结果:过表达AEG-1诱导SGC7901细胞发生EMT,同时上调eIF4E的表达;沉默AEG-1的表达抑制细胞发生EMT,同时下调eIF4E的表达;沉默AEG-1的表达抑制CXCL12诱导的细胞迁移,同时下调eIF4E的表达;过表达eIF4E部分逆转由于沉默AEG-1的表达引起的胃癌细胞迁移的抑制作用。结论:AEG-1通过上调eIF4E表达促进胃癌细胞的迁移。

RIP3/MLKL通过激活4EBP1-eIF4E通路诱导程序性坏死

目的:程序性坏死是一种由受体相互作用蛋白3(receptor interacting protein 3,RIP3)和混合谱系激酶域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)介导的细胞死亡形式,有研究指出哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路可能参与程序性坏死的调控,真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4Ebinding protein 1,4EBP1)-真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)通路是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白最重要的下游分子通路之一,然而此通路是否参与程序性坏死的发生,目前尚无相关研究。本研究旨在探索4EBP1-eIF4E通路在程序性坏死中是否发生改变。方法:首先向小鼠上皮样成纤维细胞系L929细胞中加入程序性坏死诱导剂TSZ(TNF-α/SM-164/Z-VAD-FMK),在光学显微镜下观察细胞坏死情况;进一步向敲除RIP3和MLKL基因的L929细胞中加入TSZ,采用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色观察细胞坏死情况,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测4EBP1和eIF4E的mRNA和蛋白质表达水平。结果:野生型L929细胞用TSZ处理后,坏死细胞增加,4EBP1的mRNA和蛋白质表达水平明显下调且磷酸化的4EBP1(phosphorylated 4EBP1,p-4EBP1)/4EBP1值增加(P<0.05或P<0.01),eIF4E的mRNA表达水平明显上调且磷酸化的eIF4E(phosphorylated eIF4E,p-eIF4E)/eIF4E值增加(均P<0.01);在敲除L929细胞中的RIP3和MLKL基因后,PI阳性坏死细胞明显减少,4EBP1的mRNA和蛋白质表达水平明显上调且p-4EBP1/4EBP1值下降(P<0.05或P<0.01),eIF4E的mRNA表达水平明显下调且p-eIF4E/eIF4E值下降(均P<0.01)。结论:4EBP1-eIF4E通路在RIP3/MLKL介导的程序性坏死中发生活化。

艾灸治疗后帕金森病大鼠黑质p-mtor、p-4EBP1及α-syn表达变化

目的观察艾灸治疗对帕金森病大鼠黑质磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mtor)、磷酸化真核细胞起始因子4E结合蛋白1(p-4EBP1)及α-突触核蛋白(α-syn)表达的影响,探讨艾灸治疗帕金森病的作用机制。方法健康雄性SD大鼠60只,随机分为正常组、假手术组、帕金森病组、帕金森病艾灸组,每组15只。帕金森病组、帕金森病艾灸组采用颈背部皮下注射鱼藤酮法制备帕金森病模型,假手术组注射等浓度不含鱼藤酮的葵花油乳液,正常组不做处理。正常组、假手术组、帕金森病组不予艾灸;帕金森病艾灸组造模成功后选取足三里(双侧)、关元、风府穴施予艾灸治疗,1次/d,每次10 min,7 d为1个疗程,连续治疗2个疗程。然后对各组大鼠进行行为学评分;Western blotting检测各组大鼠黑质p-mtor、p-4EBP1,免疫组化法检测各组大鼠黑质α-syn。结果帕金森病组大鼠行为学评分与正常组和假手术组相比明显升高(P均<0.01);帕金森病艾灸组大鼠行为学评分较帕金森病组显著降低(P<0.01)。与正常组、假手术组相比,帕金森病组大鼠黑质p-mtor、p-4EBP1、α-syn表达量明显升高(P均<0.01);与帕金森病组相比,帕金森病艾灸组大鼠黑质p-mtor、p-4EBP1、α-syn表达量明显下降(P均<0.01)。结论艾灸足三里、关元、风府穴治疗帕金森病的作用机制可能是抑制了雷帕霉素靶蛋白/真核细胞起始因子4E结合蛋白通路的过度活化,遏止α-syn的过度表达,从而减轻过度表达的α-syn对多巴胺能神经元的毒性。

YTHDF1和EIF3C在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义

目的分析YTH结构域N6-甲基腺嘌呤RNA结合蛋白F1(YTHDF1)和真核翻译起始因子3C(EIF3C)在上皮性卵巢癌(EOC)中的表达及临床意义。方法回顾性分析2016年1月至2020年1月徐州医科大学附属医院初诊收治的130例EOC患者的临床资料,另选取同期因卵巢良性囊肿行手术治疗的70例患者的正常卵巢组织作为对照。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测组织中YTHDF1 mRNA和EIF3C mRNA表达水平。采用免疫组化染色检测组织中YTHDF1蛋白和EIF3C蛋白表达情况。采用Pearson相关分析探讨YTHDF1 mRNA与EIF3C mRNA表达水平的相关性。分析YTHDF1蛋白、EIF3C蛋白表达情况与EOC患者临床病理特征的关联性。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。采用Cox回归分析EOC患者预后的影响因素。结果EOC组织中YTHDF1 mRNA、EIF3C mRNA表达水平高于正常卵巢组织,差异有统计学意义(P<0.05)。EOC组织中YTHDF1蛋白、EIF3C蛋白阳性表达率高于正常卵巢组织,差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析结果显示,EOC组织中YTHDF1 mRNA与EIF3C mRNA表达呈正相关(r=0.802,P<0.001)。EOC组织中YTHDF1蛋白、EIF3C蛋白表达情况与肿瘤FIGO分期、病理分级、淋巴结转移情况具有显著关联性(P<0.05)。YTHDF1阴性患者的生存预后优于阳性患者(log-rank检验:χ^(2)=6.120,P=0.013)。EIF3C阴性患者的生存预后优于阳性患者(log-rank检验:χ^(2)=10.610,P=0.001)。Cox回归分析结果显示,FIGO分期Ⅲ期、病理分级Ⅲ级、淋巴结转移、较高的CA125水平以及YTHDF1蛋白、EIF3C蛋白阳性表达是EOC患者不良预后的独立危险因素。结论EOC组织中YTHDF1、EIF3C表达升高,与不良临床病理特征有关。YTHDF1和EIF3C是潜在的评估EOC预后的生物标志物。

乳腺癌组织中eIF4E、eIF5A2、KLF4、YAP1的表达水平及临床意义

目的:探讨乳腺癌组织中真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)和5A2(eIF5A2)、Krüppel样因子4(KLF4)、Yes相关蛋白1(YAP1)的表达水平及临床意义。方法 :将接受手术治疗的乳腺癌组织50例作为观察组,同时选取50例癌旁正常组织作为对照组,检测两组eIF4E、eIF5A2、KLF4、YAP1的表达水平,分析其与乳腺癌病理特征的临床意义。结果 :观察组eIF4E、eIF5A2、YAP1阳性表达率均高于对照组(P <0.05),KLF4低于对照组(P <0.05);在临床分期Ⅰ~Ⅱ期及发生淋巴结转移的患者中,eIF4E、eIF5A2、YAP1高表达患者占比高于低表达(P <0.05),KLF4高表达患者占比低于低表达(P <0.05)。结论 :乳腺癌组织中,eIF4E、eIF5A2、YAP1水平呈高表达,KLF4水平呈低表达,是评估疾病进展的重要指标。

1,25-二羟基维生素D_3对人肾小球系膜细胞增殖、周期的影响及其机制

目的观察1,25-二羟维生素D_3(1,25-(OH)_2D_3)对人肾小球系膜细胞株增殖及细胞周期的影响,并探讨其可能作用机制。方法对数生长期人肾小球系膜株细胞分为A、B、C、D组,分别加入终浓度为10^(-8)mol/L的1,25(OH)_2D_3+含5%FBS的L-DMEM培养基、5 mg/L雷帕霉素+含5%FBS的L-DMEM培养基、5 mg/L雷帕霉素+终浓度为10^(-8)mol/L 1,25(OH)_2D_3+含5%FBS的L-DMEM培养基。给药48 h时观测各组细胞增殖及细胞周期分布,检测各组细胞真核细胞翻译起始抑制因子4E结合蛋白(4E-BP1)、磷酸化4E-BP1蛋白。结果给药48h时A、B、C组的细胞凋亡率分别为38.02%、55.62%、99.23%,组间比较,P均<0.05。给药48 h时,A、B、C组G_1期细胞所占比例明显高于D组(P均<0.05),S、G_2/M期细胞所占比例明显低于D组(P均<0.05);B、C组G_1期细胞所占比例明显高于A组(P均<0.05),S、G_2/M期细胞所占比例明显低于D组(P均<0.05);C组G_1期细胞所占比例明显高于B组(P均<0.05),S、G_2/M期细胞所占比例明显低于B组(P均<0.05)。A、B、C组细胞4EBP1、磷酸化4E-BP1蛋白相对表达量及磷酸化4E-BP1/4E-BP1均低于D组(P均<0.05);B、C组细胞4E-BP1、磷酸化4E-BP1蛋白相对表达量及磷酸化4E-BP1/4E-BP1均低于A组(P均<0.05);C组细胞4E-BP1、磷酸化4EBP1蛋白相对表达量及磷酸化4E-BP1/4E-BP1均低于B组(P均<0.05)。结论 1,25(OH)_2D_3可抑制人肾小球系膜细胞株的增殖,阻滞细胞周期于G_1期,其机制可能为1,25-(OH)_2D_3下调4E-BP1的表达。

病毒的调控靶点eIF4E

真核翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)在翻译调控过程中参与多种细胞过程,包括细胞增殖、凋亡和分化等。eIF4E在病毒m RNAs的翻译机制过程中起重要作用,不仅影响病毒蛋白合成,还可促进已感染细胞增殖以及病毒活性再激活。针对eIF4E的靶向治疗,将为以病毒感染为主的恶性肿瘤治疗提供新的思路。

苦参碱抑制宫颈癌HeLa细胞增殖作用及机制

目的探讨苦参碱对人宫颈癌HeLa细胞体外增殖的抑制作用及其分子机制。方法以不同浓度(0.5、1.0、1.5、2.0g/L)的苦参碱分别处理HeLa细胞24、48、72h后,应用MTT法检测细胞增殖抑制率,WesternBlot方法检测培养48h细胞中真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)、4E结合蛋白1(4E-BP1)蛋白表达情况;1.0g/L的苦参碱作用HeLa细胞1、3、6、12h后,Western Blot方法测其eIF4E、4E-BP1蛋白磷酸化水平。结果苦参碱明显抑制HeLa细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性:在相同时间内,随着苦参碱浓度的增加,HeLa细胞的增殖抑制率明显升高(F=235.035,P<0.05);在同一浓度时,随着苦参碱作用时间的延长,HeLa细胞的增殖抑制率也明显升高(F=320.207,P<0.05);2.0g/L苦参碱作用72h对HeLa细胞增殖抑制率最大,为(65.30±2.17)%。不同浓度苦参碱处理HeLa细胞48h后,eIF4E、4E-BP1蛋白的表达均无明显变化(F=0.171、0.932,P>0.05)。1.0g/L苦参碱作用于HeLa细胞不同时间后,细胞中eIF4E、4E-BP1蛋白磷酸化水平均降低,且呈时间依赖性(F=43.48、107.23,P<0.01)。结论苦参碱可以明显抑制体外培养宫颈癌HeLa细胞的增殖,其作用可能是通过抑制eIF4E以及4E-BP1的磷酸化,从而抑制蛋白翻译来实现的。

下调miRNA-99b表达对脑胶质瘤细胞侵袭及mTOR／4E-BP1信号通路调控的影响

目的探讨下调微小RNA（miRNA）-99b表达对脑胶质瘤细胞侵袭的影响及其作用机制。方法体外常规培养脑胶质瘤U251细胞。（1）将U251细胞分为空白对照组、无义序列对照组和miRNA．99b抑制物组，后2组分别转染无义序列和miRNA-99b抑制物，空白对照组不做任何处理。采用RT-PCR检测U251细胞中miRNA-99b、哺乳动物雷帕霉素靶分子（mTOR）mRNA的表达，采用Westernblotting检测U251细胞中mTOR、真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）及磷酸化（p）-4E-BP1蛋白的表达，采用Transwell侵袭实验检测U251细胞的侵袭能力。（2）将U251细胞分为无义序列对照组、mTORsiRNA组，分别转染无义序列和mTORsiRNA。采用RT—PCR检测U251细胞中miRNA-99b、mTORmRNA的表达，采用Westernblotting检测U251细胞中mTOR、p-4E-BPl蛋白的表达。f3）将U251细胞分为miRNA-99b抑制物＋无义序列对照组、miRNA-99b抑制物＋mTORsiRNA组，分别转染miRNA-99b抑制物＋无义序列、miRNA-99b抑制物＋mTORsiRNA。采用Westcrnblotting检测U251细胞中P-4E-BP1蛋白的表达，采用Transwell侵袭实验检测U251细胞的侵袭能力。结果（1）与空白对照组、无义序列对照组比较，miRNA-99b抑制物组U251细胞中miRNA-99bmRNA表达明显降低，mTORmRNA及蛋白表达明显升高．P-4E．BPl蛋白表达明显升高，穿膜细胞数明显增多，差异均有统计学意义（P〈0．05），而4E-BP1蛋白表达差异无统计学意义（P〉0．05）。（2）与无义序列对照组比较，mTORsiRNA组U251细胞中mTORmRNA及蛋白表达明显降低，P-4E-BP1蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义（P〈0．05），而miRNA-99bmRNA表达差异无统计学意义（P〉O．05）。（3）与miRNA-99b抑制物＋无义序列对照组比较，miRNA-99b抑制物＋roTORsiRNA组U251细胞中P-4E．BP1蛋白表达明显降低．穿膜细胞数明显减少，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论下调miRNA．99b表达可促进脑胶质瘤细胞侵袭，其作用机制与mYOR／4E-BP1信号通路调控有关。

基于mTOR/p70S6K/4EBP1通路探讨白花丹素对糖尿病肾病大鼠足细胞凋亡的影响

目的:探究白花丹素对糖尿病肾病(DN)大鼠足细胞凋亡及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)/真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)通路的影响。方法:SD大鼠分为正常对照组、模型对照组、雷帕霉素2 mg/kg组、白花丹素50、100 mg/kg组、白花丹素100 mg/kg+自噬抑制剂2 mg/kg组,每组12只。除正常对照组外,其余各组采用高脂高糖饲料喂养联合链脲佐菌素腹腔注射的方法建立DN大鼠模型,造模成功后,各组给予相应药物处理,1次/d,连续给药8 w。每日观察大鼠的一般状态,并比较给药前后大鼠的体质量变化;检测大鼠24 h尿微量白蛋白(U-mAlb)含量,并检测空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)含量;过碘酸雪夫染色观察肾组织病理学变化;免疫组织化学法检测足细胞标志蛋白足细胞裂孔膜蛋白(Nephrin)、肾母细胞瘤基因1(WT-1)的表达;透射电镜观察肾小球足细胞超微结构变化;蛋白印迹法检测肾脏组织凋亡、自噬和mTOR/p70S6K/4EBP1通路相关蛋白的表达。结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠的一般状态较差,出现肾小球基底膜增厚、系膜基质增多等肾脏病理损伤以及肾小球足细胞足突倒伏、足突相互融合、部分足突消失,24 h U-mAlb、FBG、Scr、BUN含量、肾组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(BAX)蛋白和mTOR(p-mTOR)/mTOR、p70S6K(p-P70S6K)/P70S6K、4EBP1(p-4EBP1)/4EBP1蛋白比值明显升高(P<0.05),肾组织Nephrin、WT-1、B淋巴细胞瘤-2基因(BCL-2)、自噬相关基因12(Atg12)蛋白和微管相关蛋白1轻链3(LC3)-II/LC3-Ⅰ蛋白比值明显降低(P<0.05);与模型对照组比较,白花丹素50、100 mg/kg组大鼠的一般状态、肾脏病理和肾小球足细胞损伤明显改善,24 h U-mAlb、FBG、Scr、BUN含量、肾组织Caspase-3、BAX蛋白、p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/p70S6K、p-4EBP1/4EBP1蛋白比值明显降低(P<0.05),肾组织Nephrin、WT-1、BCL-2、Atg12蛋白、LC3-II/LC3-Ⅰ蛋白比值明显升高(P<0.05);自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤能减弱白花丹素100 mg/kg对DN大鼠的改善作用(P<0.05)。结论:白花丹素可能通过抑制mTOR/P70S6K/4EBP1信号通路,激活自噬,抑制足细胞凋亡,进而减轻DN大鼠肾脏损伤。