四环素调控的真核表达体系Hep3B Tet-On细胞株的建立

目的 建立可受四环素诱导调控的高表达外源基因的真核表达体系Hep3BTet On细胞株 ,用于基因功能的研究。方法 将pTet On质粒用脂质体介导法转染Hep3B细胞 ,经G4 18筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化。单克隆分别扩增后 ,瞬时转染pTRE luc(编码荧光素酶蛋白 )质粒 ,Dox诱导表达后 ,检测荧光素酶活性 ,逐一筛选四环素调控高表达外源基因的Hep3BTet On细胞株。结果 成功构建了一株受Dox调控的高表达低背景的Hep3BTet On细胞株。结论 Hep3BTet On细胞株可用于外源基因的真核调控高表达 ,为研究真核基因功能提供了一种有力的实验手段。

人β地中海贫血IVSⅡ654(C→T)突变基因的克隆和真核表达体系的构建

目的 :克隆人 β地中海贫血IVSII654突变基因 ,构建该致病基因的体外真核表达体系。为该病基因治疗的研究提供理想模型。方法 :抽提 β 654纯合子患者DNA进行PCR扩增 ,将其克隆到pBGT51质粒中 ,然后将人 β珠蛋白基因座控制区 (LCR)及 β654基因亚克隆至真核稳定表达质粒pcDNA3 .1 +中。脂质体转染至小鼠红白血病细胞 (MEL) ,DMSO诱导MEL细胞表达 ,逆转录PCR检测人 β 654基因在MEL中的表达。 结果 :成功构建了几乎真实模拟人体内 β 654基因调控的真核表达系统。 结论 :β 654基因在MEL细胞中的表达情况同人体内 β654基因的表达完全一致 。

突变人CD59分子真核表达体系的构建和功能的初步研究

构建突变人CD59分子(HMCD59)真核表达体系,探讨HMCD59糖基化前后抗补体活性的变化。采用重组PCR定点诱变技术在CD59易于糖基化的位点构建CD59突变基因,克隆入真核表达质粒pALTER-MAX。利用阳离子脂质体将重组质粒和pcDNA3共转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。G418压力筛选稳定转染细胞克隆,检测筛选HMCD59蛋白高表达株。免疫印迹技术(Western blot)检测出HMCD59蛋白分子量约为20kDa。2,7-二羧乙基-5,6羧基荧光素(BCECF)释放实验初步证实HMCD59具有抗补体活性,糖基化后抗补体活性明显降低,为进一步研究糖尿病血管增殖症的发生机制提供了线索。

模拟mIL-18天然生成真核表达体系的构建及生物活性初探

目的 构建模拟小鼠IL 18(mIL 18)天然生成真核表达体系 ,并探讨其与人IL 2 (hIL 2 )真核表达载体pVR10 12 hIL 2 (phIL 2 )体内外共转染对细胞免疫功能的影响。方法 分别构建小鼠IL 18前体 (mproIL 18)和小鼠IL 1β转换酶 (mICE)的真核表达载体pVR10 12 mproIL 18(pmproIL 18)和pEGFP N1 mICE(pmICE)。两者单独或共转染COS 7细胞 ,分别在mRNA和蛋白水平检测IL 18的表达 ;将pmproIL 18、pmICE和phIL 2 3种真核表达载体分别通过体内、外共转染 ,初步检测其生物学活性。结果 pmproIL 18及pmICE构建正确 ,分别转染COS 7细胞后能检测到相应mRNA表达。在pm proIL 18单独或pmproIL 18/pmICE共转染的COS 7细胞中能检测到前体和成熟 2种不同形式的mIL 18蛋白表达 ,并且mIL 18能分泌到上清 ;所分泌的mIL 18与hIL 2体外联合作用可增强小鼠脾细胞增殖能力。pmproIL 18、pmICE和phIL 2 3种真核表达载体联合肌肉注射的小鼠脾细胞体外杀伤同基因型肿瘤细胞的能力显著提高。结论 构建的模拟mIL 18天然生成的真核表达体系 (pmproIL 18/pmICE)与phIL 2共转染有可能用于肿瘤的基因治疗。

碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的 构建人碱性成纤维细胞生长因子 ( basic fibroblast growth factor,b FGF)真核表达质粒 ,研究其在体内外的表达。 方法 通过基因克隆技术 ,构建并大量制备 pc DNA3.1/ myc- His( - ) C- b FGF真核表达体系 ,RT-PCR和细胞免疫组织化学方法检测体外瞬时表达情况 ;直流电脉冲介导重组质粒 pc DNA3.1/ myc- His( - ) C- b FGF和p CD2 -血管内皮细胞生长因子1 2 1 ( vascular endothelial growth factor,VEGF1 2 1 )在兔颈部肌肉瓣内转移并表达 ,测定其促血管生成的生物学效应。 结果 构建的 pc DNA3.1/ myc- His( - ) C- b FGF真核表达体系成功转染体外培养 He L a细胞 ,目的基因在 m RNA水平和蛋白水平均有表达。 pc DNA3.1/ myc- His( - ) C- b FGF和 p CD2 - VEGF1 2 1 重组质粒分别转染在体肌瓣 ,获得外源基因高水平表达。转基因肌肉发生血管增生、血流增强的生物学效应。 结论 构建了人 b FGF真核表达质粒 ,并可在体内外顺利表达 。

鼠白细胞介素-2(mIL-2)真核表达质粒的构建及蛋白检测

目的构建重组鼠白细胞介素2的真核表达体系,获得mIL2基因的表达质粒,用其提高DNA疫苗的免疫原性。方法从经PMA刺激的小鼠脾细胞中提取总RNA,采用RTPCR技术调取鼠白细胞介素2基因,并将其克隆至真核表达质粒VR1012中,转染COS7细胞,将转染细胞裂解,进行Westernblot检测。结果获得完整的带有信号肽的mIL2序列的质粒,经Westernblot检测阳性。结论构建了mIL2真核表达体系,并获得有生物活性的mIL2蛋白。

番茄LeEIL1基因表达工程菌的构建及表达分析

以番茄果实为材料,通过RT-PCR扩增出番茄LeEIL1基因,并构建了3种表达载体。表达结果比较分析表明,在以pPIC9k为表达载体,KM71毕赤酵母为宿主细胞的真核表达体系中,LeEIL1蛋白质的表达结果明显优于在以pET30a和pET15b为载体,BL21(DE3)plyss大肠杆菌为宿主细胞的原核表达体系中的表达结果。

人α干扰素基因在家蚕细胞和家蚕中的高表达及药学试验

用生物技术大规模生产药物已形成产业化,取得了令人鼓舞的结果。

再谈抗菌肽及其在水产养殖上的应用(下)

2.真核系统表达抗菌肽的研究 酵母作为工程菌表达外源蛋白质技术是近年来日益发展的真核表达体系。酵母作为低等真核生物,具有细胞生长快、营养要求低、易于规模化生产、遗传操作简单等特点,能够对表达的蛋白质进行正确加工、修饰及合理的空间折叠,不会产生内毒素,并且一些类型的酵母其表达产物可分泌至胞外,既可以减轻宿主细胞代谢负荷,又可减少宿主细胞蛋白质酶对外源蛋白质的降解,提高表达蛋白质的活性,且可获得较高的表达量,利于表达产物的分离纯化,非常有利于真核生物基因的表达.