基因ifi56在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化中的表达及其真核表达质粒的构建

本研究探讨ifi56基因在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化中的表达,构建人ifi56真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位情况。用RT-PCR技术检测APL细胞NB4经维甲酸处理不同时间后ifi56的表达,并从白血病细胞NB4中扩增ifi56全长编码序列,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,转染到293T细胞中,提取细胞蛋白,用Western blot方法检测蛋白表达情况,荧光显微镜检测IFI56的定位。结果表明,ifi56在未经处理的NB4细胞中几乎检测不到,当用维甲酸处理72小时后明显升高,并成功将ifi56插入到质粒pEGFP-C1中,Western blot检测到融合蛋白表达,分子量约为83 kD。IFI56重组蛋白在293T细胞内主要定位于细胞胞浆中。结论:ifi56表达随着APL细胞分化明显升高,成功构建ifi56基因真核表达载体,IFI56蛋白主要定位于细胞浆。

AY358935基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建AY358935基因的真核表达质粒并进行初步鉴定。方法以逆转录聚合酶链反应（reverse transcription—polymerase chain reaction，RT-PCR）扩增AY358935基因的cDNA，将该片段克隆进pGEM-Teasy载体；以测序正确的pGEM-T-AY重组质粒为模板构建pcDNA3．1-Ay真核表达质粒，并进行双酶切鉴定。以pcDNA3．1-Ay瞬时转染M14细胞，Western印迹法和3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di_phenytetrazoliumromide，MTT]比色法分别检测转染细胞AY358935蛋白表达水平及细胞增殖力。结果RT-PCR扩增片段符合AY358935基因cDNA大小，与pcDNA3．1诅y克隆区酶切片段-致。对pGEM-T-AY质粒克隆区测序，结果也与AY358935基因cDNA序列相同。M14细胞分别转染AY358935基因、peDNA3．1和脂质体48h后，AY358935基因组蛋白表达水平明显高于其余两组，且AY358935基因组细胞A值（0．74）也明显高于其余两组（0．39和0．46），差异有统计学意义（P〈0．05）。结论AY358935基因的真核表达质粒pcDNA3．1-Ay构建成功，AY358935基因可能具有促进M14细胞增殖的作用。