绵羊GSTA2基因克隆、生物信息学分析及真核表达载体构建

为阐明绵羊谷胱甘肽S转移酶α2(Glutathione S-transferase alpha 2,GSTA2)基因功能,利用牛GSTA2基因序列设计引物,提取绵羊皮肤组织总RNA,应用RT-PCR、基因克隆、生物信息学对GSTA2基因进行研究,构建真核表达载体,转染绵羊皮肤成纤维细胞,应用qPCR技术检测GSTA2基因的表达。结果表明,克隆到绵羊GSTA2基因672 bp编码区序列(GenBank登录号:OR440604.1),编码223个氨基酸,分子量为25.39 ku。氨基酸比对和系统进化树分析表明,绵羊与牛的GSTA2相似度最高,达87.39%。GSTA2的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建的真核表达载体pcDNA3.1-GSTA2转染绵羊皮肤成纤维细胞后,GSTA2基因表达量极显著上调(P <0.001)。说明成功克隆了绵羊新基因GSTA2的CDS序列,并成功构建了其真核表达载体。

pEGFP-C2-GATA4真核表达载体的构建及在P19细胞中的表达

目的:构建小鼠GATA4基因融合绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C2-GATA4,并检验其在P19细胞中的瞬时表达.方法:以真核表达质粒pEFSA-GATA4为模板,PCR扩增得到小鼠GATA4基因片段,将目的片段亚克隆到pEG-FP-C2载体,卡那霉素筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定.将重组质粒pEGFP-C2-GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞,用免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GATA4在P19细胞中的表达.结果:酶切、测序结果表明将基因片段GATA4正确插入pEGFP-C2载体,并可在P19细胞中检测到GATA4基因和GATA4-EGFP融合蛋白表达.结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-C2-GATA4,并在P19细胞瞬时表达成功,为进一步研究GATA4在心脏发育中的作用奠定了基础.

pEGFP-C3/SUMF2重组真核表达载体的构建及在人支气管上皮细胞中的表达

目的构建与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合的人硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)真核表达载体。方法用RT-PCR技术从人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBEC)获得SUMF2的cDNA模板,PCR方法扩增人SUMF2基因。用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切扩增人SUMF2基因及质粒pEGFP-C3;将2种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10;挑取菌落培养,提取质粒,酶切鉴定,测序;将测序正确的重组载体用脂质体法转染HBEC,荧光倒置显微镜观察。提取转染细胞的总蛋白进行Western blot检测。结果扩增出1条约857bp的片段,与预期的SUMF2大小相符。酶切结果显示重组质粒pEGFP-C3/SUMF2被切成2条片段,其中1条为pEGFP-C3载体,另1条为目的片段。经测序鉴定,序列与GenBank(NM_015411.2)中的序列高度同源。荧光倒置显微镜观察显示,人SUMF2基因主要在内质网表达。Western blot结果显示在相对分子质量为37×103处有一蛋白条带,与预期大小相符。结论成功构建重组表达载体pEGFP-C3/SUMF2,为进一步研究SUMF2对IL-13的作用奠定了实验基础。

TFAP2A基因重组真核表达载体的构建及鉴定

目的构建转录因子增强子结合蛋白-2α的真核表达载体并进行鉴定,为TFAP2A的后续研究提供有效工具。方法采用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对真核表达载体CV702质粒进行酶切获得线性化载体;通过PCR扩增制备TFAP2A的cDNA片段,将线性化载体和TFAP2A的cDNA扩增产物进行体外环化连接,构建CV702-TFAP2A重组质粒。将连接产物进行细菌转化,挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定,对阳性克隆进行测序及结果分析。将CV702-TFAP2A重组真核表达载体转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,通过Western blot检测TFAP2A的表达效率。结果菌落PCR扩增和测序结果显示,CV702-TFAP2A重组真核表达载体构建成功;Western blot结果与Image J灰度值分析结果显示,与CV702对照载体相比,转染CV702-TFAP2A重组质粒的MDA-MB-231中的Flag-TFAP2A蛋白相对表达量更高(P<0.05)。结论成功构建CV702-TFAP2A的重组真核表达载体,证实转染CV702-TFAP2A的细胞中Flag-TFAP2A的表达水平升高。

人pEGFP-C2-PRDX3真核表达载体构建与在人髓母细胞瘤DAOY细胞中表达

目的构建人pEGFP-C2-PRDX3真核表达载体,并检测其在人髓母细胞瘤DAOY细胞中的表达。方法从人髓母细胞瘤DAOY细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法对编码PRDX3的基因片段进行扩增,应用基因重组技术,将目的片段亚克隆到pEGFP-C2真核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定后,用脂质体法将重组质粒转染入DAOY细胞,分别采用RT-PCR法、West-ern blot法检测PRDX3在DAOY细胞中的表达。结果双酶切及测序结果验证PRDX3片段正确插入pEGFP-C2质粒,转染后的PRDX3基因mRNA及蛋白质水平均明显上调。结论成功构建了具有报告基因-增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达载体pEGFP-C2-PRDX3,为进一步研究PRDX3基因在人髓母细胞瘤中的生物学功能奠定了基础。

大鼠pEGFP-C3/BMP-2真核表达载体的构建

目的通过克隆大鼠的BMP2基因,构建EGFP-C3/BMP2基因的真核细胞表达载体。方法把大鼠的基因组DNA通过PCR获得BMP2,克隆构建载体pEGFP/C3-BMP2,并将其转化到大肠杆菌里面,最后进行重组真核表达载体pEGFP-C3-BMP2的构建和鉴定,并可观察其在真核细胞中的表达。结果以大鼠总DNA为模板扩增出1200 bp左右的特异性条带,测序结果与Gene-Bank测序结果相比,翻译成的氨基酸序列相同并完全一致,并可在真核细胞中表达。对重组质粒pEGFP-C3/BMP2进行双酶切鉴定并测序,结果也完全一致。结论为进一步研究利用BMP2基因修饰骨组织工程骨,促进骨折愈合再生提供实验基础。

pEGFP-C2/LAT-ORF3真核表达载体的构建及其在Vero细胞中的表达

克隆单纯疱疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virusⅡ,HSV-2)潜伏相关转录体(latency associated transcript,LAT)第3个开放阅读框(open reading frame3,ORF3)的DNA序列,构建pEGFP-C2/LAT-ORF3真核表达载体,并观察其在非洲绿猴肾细胞(Vero)中的表达,为进一步研究LAT基因及ORF3的生物学功能奠定基础。用HSV-2333株感染Vero细胞,从Vero细胞培养液中收集HSV-2并提取HSV-2基因组。以HSV-2基因组为模板,PCR扩增得到HSV-2LAT ORF3DAN片段。将ORF3片段连接到pEGFP-C2质粒上,用卡那霉毒筛选阳性克隆,经菌落PCR,双酶切及测序验证pEGFP-C2/LAT-ORF3真核表达载体构建成功。用Xfect转染试剂将重组载体转染入Vero细胞,倒置荧光显微镜观察其在Vero细胞中的表达。双酶切及测序结果验证ORF3片段正确插入pEGFP-C2质粒,荧光显微镜观察到融合蛋白在转染的Vero细胞中的表达。成功构建pEGFP-C2/LAT-ORF3真核表达载体,该重组质粒能在Vero细胞中成功表达。

细胞因子与猪瘟病毒E_2基因真核双表达载体的构建及其免疫增强作用

构建了猪瘟病毒E2 基因与IL 2、IL 3基因的双表达真核表达载体 ,观察其表达水平 ,并对其免疫增强效果进行了观察。结果表明 ,构建了 2种猪瘟病毒E2 基因与白细胞介素 2、3的真核表达质粒pIRSTIL 2 ,pIRSTIL 3。将 2种质粒转染BHK 2 1细胞 ,均可在体外表达E2 抗原和有生物活性的IL 2、IL 3两种质粒能诱导产生CSFV的特异性免疫反应。pIRSTIL 2 ,pIRSTIL 3所诱导的免疫应答反应比使用单表达质粒 pIRST强。试验表明 ,细胞因子与目的基因构建的双表达基因疫苗能有效提高基因疫苗的免疫效果。

IL-2/Fc融合基因真核表达载体的构建和表达

目的 :构建含人IL 2cDNA基因和免疫球蛋白Fc片段融合基因的真核表达载体pcDNA 3.1IL 2 /Fc ,并在真核细胞中表达 ,以期用于乙型肝炎病毒 (HBV)DNA疫苗的研究。 方法 :应用重叠延伸剪切技术 (SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段IL 2 /Fc,回收后克隆到中间 pGEM TEasyTA克隆载体 ,得到合适的酶切位点后 ,用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA 3.1中 ,得到真核重组载体 pcDNA 3.1IL 2 /Fc。然后用脂质体法转染SP2 / 0细胞。 结果 :对重组载体进行限制性酶切鉴定及测序分析 ,证明连接正确 ;经ELISA检测证实 ,该重组载体能够在真核细胞中外分泌表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。 结论 :成功构建了真核表达载体 pcDNA 3.1IL 2 /Fc ,并在SP2 / 0细胞中有效表达。

小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因表达检测及真核表达载体构建

目的检测及克隆小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因,构建真核表达载体。方法设计寡核苷酸探针,应用原位分子杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因的mRNA表达,RT-PCR法从A20细胞总RNA中获取mCD99L2 基因含编码区全长cDNA,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定;设计含酶切位点的PCR引物,PCR 获取含mCD99L2基因编码区片段,用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切取所需目的片段,利用分子克隆技术与 pcDNA3．1／MycHis C(+)质粒重组,对产生的重组子进行PCR、双酶切鉴定,并经过测序证实。结果原位杂交方法检测 A20细胞中mCD99L2基因mRNA呈阳性表达;RT-PCR法成功获得mCD99L2基因编码区全长cDNA序列,DNA序列测序结果与GenBank提供的已知序列(NM-138309)比较,结果完全一致;重组质粒pcDNA3．1-mCD99L2中的插入片段经DNA测序后与GenBank中mD99L2基因相应序列比较,100％同源。结论小鼠B淋巴瘤A20细胞株存在 mCD99L2基因,采用RT-PCR和T-A技术克隆了A20细胞的mCD99L2基因,成功构建了pcDNA3．1-mCD99L2真核表达载体,为下一步探索mCD99L2基因在小鼠B淋巴瘤A20细胞株中的功能奠定了实验基础。

人骨形态发生蛋白-2基因克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人骨形态发生蛋白-2(hBMP2)基因片段,构建pcDNA3.1-hBMP2真核表达质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人骨肉瘤中扩增出人骨形态发生蛋白-2基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1真核表达载体上,构建pcDNA3.1-hBMP2重组质粒,通过用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果经PCR扩增、酶切电泳分析和DNA测序证实,本实验构建的重组质粒目的基因片段为人BMP2-cDNA。结论本实验成功克隆了hBMP2基因并构建成其真核表达质粒。

克隆并构建人骨形成蛋白2真核表达载体

目的探讨构建人骨形成蛋白2(humanbonemorphgeneticprotein2,hBMP-2)真核表达载体的方法。方法由人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA,利用RT-PCR方法扩增获得hBMP-2基因cDNA,将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM-T-hBMP-2重组质粒载体,转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用EcoR和Not双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3.1(+)真核表达载体,将克隆载体中hBMP基因重组到pcDNA3.1(+)真核表达载体,提取质粒作酶切电泳、PCR鉴定及DNA测序。结果人骨肉瘤细胞中经RT-PCR得到1.2kbp的hBMP-2扩增条带,重组质粒pGEM-T-hBMP-2经酶切电泳可见1.2kbp的hBMP-2条带和4.0kbp的载体片断;pcDNA3.1-hBMP-2质粒经酶切电泳可见1.2kbp的hBMP-2条带和5.0kbp的载体片断,重组质粒酶谱分析与预期一致;DNA序列分析测序结果校对后经BLAST分析,表明核酸序列与GeneBank中和hBMP-2的mRNA序列完全吻合。结论通过此方法能成功克隆获得hBMP-2基因,并构建其真核表达载体。

新疆细毛羊pEGFP-C2-KAP6.1真核表达质粒的构建与鉴定

试验采集新疆细毛羊皮肤组织,提取RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出KAP6.1基因,并通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-C2真核表达载体上,构建pEGFP-C2-KAP6.1重组质粒,并进行PCR、酶切鉴定。结果表明,本试验成功构建了新疆细毛羊的pEGFP-C2-KAP6.1真核表达重组质粒,为进一步研究该基因所编码的蛋白与毛品质的关系,以及培育超细羊毛等经济性生物学性状相互关系提供理论依据。

黄牛MEF2A基因克隆及真核表达载体构建

旨在克隆MEF2A基因和构建其真核表达载体,为黄牛种质资源保存利用以及肉牛转基因育种和产业化提供基因资源和育种素材。本研究通过RT-PCR克隆黄牛MEF2A基因CDS区,并将其插入到质粒载体pEGFP-C1的多克隆位点中,构建真核表达载体pEGFP-C1-MEF2A。同时应用生物学软件分析MEF2A基因及其编码蛋白的生物学特性,了解其复杂的调控机能。结果,MEF2A基因的CDS区全长1 494bp,编码498个氨基酸残基。生物信息学分析表明,N端第2～56位氨基酸肽段为MADS-box结构域,第57～77位氨基酸肽段为MEF2结构域;C端没有明显的功能域。成功的构建了含有牛MEF2A基因的真核表达载体pEGFP-C1-MEF2A。

大肠杆菌植酸酶appA2基因联合人MxA基因真核表达载体的构建及表达研究

本研究旨在探讨通过构建同时表达大肠杆菌植酸酶appA2及人抗黏液病毒基因A(Myxovirus resistance gene,MxA)的真核表达载体,比较双基因表达载体和相应单基因表达载体中外源基因的表达效率;从pcDNA-ap-pA2载体上扩增CMV-appA2-BGHpA片段,通过MluI酶切位点连接到pcDNA-MxA载体中,构建重组载体pcDNA-appA-MxA(下称AMP),分别将pcDNA3.1(+)、pcDNA-MxA、pcDNA-appA2及AMP质粒转染猪PK15细胞,经G418筛选后,取细胞通过实时荧光定量PCR测定细胞内appA2及MxA的表达,同时部分细胞通过Westernblot测定细胞内MxA蛋白表达量,采用改进的钼酸铵显色法测定细胞内植酸酶活性;酶切及测序结果表明成功构建了AMP载体;QRT-PCR结果表明,转AMP细胞组MxA表达水平是转pcDNA-MxA组的1.118倍,转AMP细胞组appA2表达水平是转pcDNA-appA2组的1.134倍,上述各组间差异显著(P<0.05)。灰度分析结果表明,AMP细胞组细胞内MxA表达量是转染pcDNA-MxA细胞组的1.07倍;植酸酶活性测定试验结果表明,转AMP、pcDNA-appA2细胞组及对照组细胞内植酸酶酶活和对照组平均酶活分别为0.294、0.235及0.082FTU·μL-1,2个试验组间差异不显著,试验组和对照组间差异极显著(P<0.01);试验结果表明本研究构建双基因表达载体中外源基因的表达效率比相应单基因表达载体表达效率高,本研究为以后多基因共表达及制备多基因转基因动物奠定了基础。

转化生长因子β2真核表达载体pcDNA3.1(+)/TGF-β2的构建及其在骨髓基质细胞的表达

目的 :构建人转化生长因子 β2的真核表达载体 pcDNA3.1(+) /TGF - β2 ,检测其转染骨髓基质细胞后的表达。方法 :用PCR方法从人胎盘cDNA文库DNA中扩增TGF - β2全长cDNA ,该基因片段两端设计了NheⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将TGF - β2的cDNA构建到真核表达载体 pcDNA3.1(+)上 ,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术 ,将所构建的载体导入从骨髓中分离培养的基质细胞中 ,体外单层培养。分别于转染后 2 4h和 4周利用RT -PCR和Western -Blotting方法检测目的基因的表达情况。结果 :经琼脂糖凝胶电泳及测序证实 ,PCR获得的片段与GenBank中登记的TGF - β2cDNA序列完全相同。pcDNA3.1(+) /TGF - β2酶切片段的长度与理论大小相符。转染后不同时期的骨髓基质细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到TGF - β2的表达。结论 :pcDNA3.1(+) /TGF - β2真核表达载体构建成功 。

鹅细小病毒VP2基因原核及真核表达载体的构建

将鹅细小病毒VP2基因克隆到原核表达载体 pPROEX HTb及真核转移载体pFASTBAC HTb中 ,重组真核转移载体在DH10BAC 中经转座作用 ,成功构建了表达VP2基因的原核表达载体pPROEX HTb VP2和杆状病毒表达载体BAC VP2。经限制性内切酶酶切及PCR分析 。

SK2和JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:构建SK2和JPH2双基因重组真核表达载体p IRES-EGFP/SK2+JPH2,并检测其在转染后HEK293细胞中的表达。方法:以p CMV6-entry/SK2为模板,PCR扩增出SK2片段,通过BgⅢ/HindⅢ酶切位点克隆入真核表达载体p IRES-EGFP,将JPH2序列插入构建的SK2表达载体p IRES-EGFP-SK2,并通过酶切及测序鉴定。脂质体转染法将重组质粒p IRES-EGFP/SK2+JPH2转染HEK293细胞,采用Western blot法检测SK2通道蛋白和JPH2蛋白的表达。结果:构建的重组真核表达载体p IRES-EGFP/SK2+JPH2经酶切和测序鉴定,证实插入的序列与Gen Bank中的SK2和JPH2基因序列完全相同。p IRES-EGFP/SK2+JPH2质粒转染HEK293细胞48 h后,SK2和JPH2蛋白均能成功表达。结论:成功构建了重组真核表达载体p IRES-EGFP/SK2+JPH2。

人SNCA基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的:构建含人野生型及致病突变A30P、A53TSNCA基因的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synu-clein(SNCA)的单克隆PC12细胞株。方法:通过RT-PCR方法扩增SNCA基因,T-A克隆后测序。在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoR I、BamHI两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C(Ala30Pro)、G209A(Ala53Thr)的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并以PCR、双酶切、测序鉴定。以重组质粒pEGFP-C3-SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞;以G418进行筛选;以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synuclein的单克隆PC12细胞株,并以稳定转染pEGFP-C3的PC12细胞作为对照组细胞,通过RT-PCR、Western blot及荧光显微镜鉴定各单克隆PC12细胞株。结果:PCR、酶切及测序证明重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA构建成功。RT-PCR、Western blot及荧光显微镜确认目的基因序列在PC12细胞稳定过表达。结论:成功地构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA;成功获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synuclein的单克隆PC12细胞株。