限制性内切酶指纹-高效毛细管电泳激光诱导荧光法测定原核/真核质粒

采用线性聚丙烯酰胺修饰石英毛细管的高效毛细管电泳无胶筛分技术,对原核/真核质粒用不同限制性内切酶酶切,运用限制性内切酶指纹-高效毛细管电泳激光诱导荧光(REF-HPCE-LIF)检测法同时对内切酶酶切后多个和较长DNA片段进行了检测,电泳缓冲液为1×TBE(pH8.3),阴极电压进样(10kV,5s),分离电压13kV,25℃,激光诱导荧光检测器检测(λex=520nm)。结果表明,所建立的REF-HPCE-LIF方法可对原核/真核酶切后多个和较长DNA片段进行检测,获得了满意的限制性内切酶指纹图谱,能够检测片段大小相差不超过10bp。所建立的方法较琼脂糖电泳分辨率高,可应用在检测多个和较长DNA片段的突变,在诊断肿瘤方面有一定应用前景。

GPC3-siRNA真核质粒载体的构建及Huh-7细胞转染

目的探讨GPC3-siRNA真核质粒载体构建并转染Huh-7细胞的可行性。方法构建真核质粒载体pcDNA3.1+GPC3和GPC3-siRNA-1633,采用脂质体法瞬时转染至Huh-7细胞中。MTT法检测转染后Huh-7细胞的细胞活性,荧光定量PCR、Western blot分别检测GPC3 mRNA和蛋白表达。结果 GPC3-siRNA-1633基因和GPC3真核质粒载体转染Huh-7细胞后细胞存活率高,转染GPC3-siRNA-1633的Huh-7细胞出现GPC3 mRNA和蛋白表达下调。结论 GPC3-siRNA-1633可成功转染至Huh-7细胞,并抑制GPC3表达。

MPEG-PLGA纳米胶囊在真核质粒转染细胞中的应用

目的验证MPEG-PLGA纳米胶囊在真核质粒转染细胞中应用的可行性。方法利用直接溶解法将MPEG-PLGA溶解于4℃双蒸水中,加入绿色荧光载体混匀后静置于37℃恒温箱中30 min制成MPEG-PLGA/pEGFP-C3纳米胶囊复合物,检测复合物粒径大小并转染机体细胞,通过对机体细胞绿色荧光的表达判断复合物的转染效率。结果 MPEG-PLGA/pEGFP-C3粒径为28.3 nm,细胞绿色荧光显示复合物组转染率远大于裸质粒对照组。结论 MPEG-PLGA/pEGFP-C3纳米胶囊复合物可有效提高质粒的转染率,可作为一种新型跨膜载体在临床与研究中应用。

FAT10真核质粒的构建、转染及其蛋白的表达

目的构建类泛素基因FAT10的真核表达质粒,观察其蛋白在转染人胚肾细胞系293T中的表达。方法采用RT-PCR法扩增FAT10全长基因片段后,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FAT10克隆至pcDNA5-FRT表达载体并行酶切鉴定;用脂质体LipofectamineTM2000分别介导空质粒(空载组)及重组质粒(FAT10质粒组)转染293T细胞,以脂质体混合PBS(PBS组)及未加入脂质体(未转染组)作为对照。转染48 h后,收集细胞。采用Western blot法检测293T细胞中的FAT10蛋白。结果 pMD18-FAT10重组质粒经双酶切获得498 bp片段,对PCR产物及498 bp片段进行测序,结果与GenBank报道序列完全一致。FAT10质粒组、未转染组、空载体组和PBS组FAT10蛋白表达量分别为1.556±0.072、0.334±0.051、0.425±0.095、0.382±0.063,FAT10质粒组与未转染组、空载体组和PBS组比较,P均<0.05。结论成功构建了FAT10的真核表达质粒pcDNA5-FRT-FAT10,FAT10蛋白在293T细胞中高表达。

真核质粒在组织细胞内的表达时效

目的观察真核质粒在机体细胞内的表达时效,为临床基因治疗的给药间隔提供理论依据。方法取PCDNA3.1(+)-EGFP,pEGFP-C3,pIRES-GFP 3种绿色荧光真核质粒,利用脂质体2000转染机体细胞,观察绿色荧光蛋白在细胞的表达时间推断质粒在机体内的表达时效。结果 3组绿色荧光均在12 h开始表达,48 h达高峰,持续35 d后衰减。结论在基因治疗中真核质粒连接目的基因能在机体细胞内稳定表达35 d,基因给药间隔可选定为30 d。

猪流行性腹泻病毒N基因重组真核质粒构建及其表达

为探明猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)N基因编码的蛋白对PEDV感染早期诊断的作用,根据PEDV CV777株N基因全序列设计一对特异性引物以扩增N基因,定向插入到pPM-CHis真核表达载体中构建重组表达质粒pPM-C-His-N,将重组质粒肌肉注射昆明系小鼠,以检测其在小鼠体内的表达水平;将pPM-C-His-N转染至Vero细胞,分别在基因水平和蛋白水平对N基因的表达进行检测,并采用间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测N蛋白在细胞中的表达分布情况。结果表明,重组质粒在基因水平和蛋白水平均成功表达,免疫小鼠血清中抗体的效价为1∶51 200,Western-blot结果显示,免疫血清能与重组N蛋白发生特异性反应,说明实验成功构建了重组真核表达质粒pPM-C-His-N,且在Vero细胞内检测到了绿色荧光,为PEDV诊断方法的建立及致病机制的研究奠定基础。

重组真核质粒pCMV4-rZP3′构建及在小鼠体内的表达

选取兔透明带ZPC基因序列的部分片段 (编码 2 63 4 1 5位的氨基酸 ,rZP3′)作为靶抗原 ,构建兔ZP3′基因疫苗 ,研究其阻断受精的效果。提取成熟雌兔卵巢的总RNA ,RT PCR克隆兔透明带ZPC的cD NA ,直接插入到克隆质粒PCR○R 2 1中 ,构建克隆质粒PCR○R 2 1 rZPC′,再将靶片段用HindⅢ、X bal双酶切从克隆质粒PCR○R 2 1 rZPC′切下 ,1 %的低熔点琼脂糖电泳回收 ,亚克隆到真核表达质粒pCMV4中 ,构建真核表达质粒pCMV4 rZPC′。将质粒直接注射到活体小鼠的大腿内侧肌肉中 ,在mRNA水平上观察到质粒能在肌肉细胞中正确表达 ,并且其表达可以维持 1 2周以上。

利用斑马鱼胚胎快速鉴定真核质粒中目的基因表达的研究

目的建立利用斑马鱼胚胎快速鉴定真核质粒中目的基因表达的实验体系。方法选20枚斑马鱼受精卵,在显微镜下每隔1h记录胚胎的发育情况。另选250枚单细胞期斑马鱼胚胎,平均分成5组,一组胚胎作为对照,剩余4组分别向胚胎的单细胞内注射pEGFP-N1(真核表达质粒)、pCMV-DsRed-Express2(真核表达质粒)、pET28-GFP(原核表达质粒)、pET28-RFP(原核表达质粒)质粒,在不同时间点连续观察绿色荧光及红色荧光的表达情况。另选600枚单细胞期斑马鱼胚胎,平均分成3组,一组胚胎作为对照,一组向胚胎单细胞内注射pEGFP-N1质粒,另外一组向胚胎单细胞内注射pEGFP-N1-MUC1外源基因融合重组质粒,注射4h后在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况,并用RT-PCR的方法检测目的基因MUC1mRNA的转录情况。结果注射pEGFP-N1、pCMV-DsRed-Express2真核表达质粒的胚胎,注射4h后分别观察到很强的绿色荧光及红色荧光;注射pET28-GFP、pET28-RFP原核表达质粒的胚胎,10h内都未观察到绿色荧光及红色荧光;注射pEGFP-N1-MUC1外源基因融合质粒,注射4h后同样观察到很强的绿色荧光,且用RT-PCR方法检测到目的基因MUC1很强的表达。结论利用斑马鱼胚胎鉴定真核重组质粒中目的基因的表达情况是一种快速、有效的实验体系。

分泌性内皮抑制素真核质粒治疗小鼠肝癌的初步研究

目的 构建并表达分泌性内皮抑制素真核表达质粒,以此对肝癌进行基因治疗。方法 人工合成Ig κ信号肽序列,和内皮抑制素编码序列一起克隆入pcDNA3.1质粒。重组质粒转染上清液作用于ECV304内皮细胞,MTT法检测内皮细胞的增殖。局部注射重组质粒治疗接种在小鼠腿部肌肉内的H_(22)肝癌瘤株,疗程结束后解剖称取瘤重。结果 构建的内皮抑制素真核表达质粒转染上清液可以抑制内皮细胞的增殖抑制率为29.2％。经质粒裸DNA注射治疗后,治疗组瘤重[(1.34±0.96)g]比空载体组[(2.70±0.82)g]和生理盐水组[(3.73±1.41)g]明显减小(P<0.05)。结论 分泌性内皮抑制素真核表达质粒用于H_(22)肝癌的基因治疗有一定效果。

PRRSV变异株ORF6基因与IL-18共表达真核质粒的构建及其表达

针对白细胞介素18(IL-18)基因和本实验室分离的PRRSVJL/07/SW毒株全基因序列,分别设计了2对特异性引物,扩增出IL-18基因和ORF6基因。将2个目的基因克隆于真核表达载体pEGFP-N1中,成功构建了重组真核质粒pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6,阳性质粒转染Marc-145细胞进行筛选。通过表达载体在转染细胞中的高效转染,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)快速、准确的反映出阳性质粒在细胞质中的正确表达,再通过SDS-PAGE和Western blot鉴定构建的真核表达质粒pEGFP-IL18-ORF6的正确性。结果表明,ORF6基因和IL-18基因在Macr-145细胞中能有效表达。结论,所构建的真核质粒pEGFP-IL18-ORF6结构正确,能够在Marc-145细胞中高效表达,而且表达产物具有特异免疫学反应。

DP1/02株鸭源Ⅰ型副黏病毒F基因真核质粒构建及免疫试验

应用RT-PCR方法从鸭源Ⅰ型副黏病毒DP1/02株中扩增F基因并克隆入pMD18-T载体,经序列测定、分析,DP1/02株F基因与鸡新城疫病毒(NDV)国家标准强毒F48E9株的核苷酸、氨基酸序列同源性均达到99%。随后将F基因克隆入真核表达载体pCI-neo,构建真核表达质粒pCI-F,将阳性质粒体外转染Vero细胞,通过间接免疫荧光对真核质粒的表达进行鉴定,利用pCI-F质粒进行动物试验。结果表明构建的真核表达质粒pCI-F能够在Vero细胞中表达,雏鸭免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,二次免疫雏鸭后,对NDV强毒的攻毒保护率为73%。本试验为利用F基因构建的核酸疫苗提供了重要的技术支持。

IL-1Ra和IL-10真核表达质粒载体的构建及其表达检测

目的:构建人IL-1Ra和人IL-10真核表达质粒载体并检测其表达。方法:用双酶切方法切取PCDI-IL-1Ra和PCDI-IL-10质粒中包含人IL-1Ra和人IL-10 CDS全长序列的cD-NA片段,并分别连接到真核表达质粒pcDNA3.1上,然后用壳聚糖转染上述质粒到原代软骨细胞,RT-PCR检测其mRNA水平的表达。结果:成功将人IL-1Ra和IL-10 CDS全长序列的cDNA片段克隆到真核表达载体,mRNA水平检测到目的基因的表达明显提高。结论:真核表达质粒可以用于外源基因的原代软骨细胞导入和表达,为进一步的基因治疗研究提供依据。

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2分段真核表达及其细胞定位分析

为探讨非结构蛋白2(non-structural protein 2,NSP2)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)复制过程中的作用及机制,本研究构建真核重组质粒pcDNA 3.1-5'Flag-NSP2-147-323,并瞬时转染至HEK 293T中,同时设置完整NSP2基因序列重组质粒作为对照,转染48 h后分别用不同的抗体进行间接免疫荧光监测。结果显示,转染对照组中细胞核周围可见特异性荧光,而转染真核重组质粒pcDNA 3.1-5'Flag-NSP2-147-323后,不仅在细胞核周围,在细胞核内也可以观察到特异性荧光。本研究成功构建真核重组质粒pcDNA 3.1-5'Flag-NSP2-147-323,并可在HEK 293T细胞中正确表达,为进一步研究NSP2在PRRSV复制过程中的作用提供依据和基础。

反义RNA和反义硫代寡核苷酸抗HBV转基因小鼠病毒疗效的比较

目的 比较人工合成的反义硫代寡核苷酸 (asODN )和反义RNA真核表达质粒 (PCEP4-ac)在乙型肝炎(HBV)病毒转基因小鼠体内的抗病毒作用。 方法 设计合成针对HBV -pre -c/c基因的反义硫代寡核苷酸 5‘ -CAT GCCCCAAAGCCAC -3’。构建HBV -c区反义RNA真核表达质粒 (PCEP4-ac) ,并以半乳糖 -多聚赖氨酸 (Gal15 -PLL)作肝靶向载体。将 2 0只HBV转基因小鼠分为反义寡核苷酸、反义RNA真核质粒表达、生理盐水组。靶向反义硫代寡核苷酸以每只体重 15 0ug剂量 ,反义RNA真核质粒每只 10 0ug剂量 ,尾静脉注射给药 ,对照组用同样体积生理盐水同样方法给药。 结果 注射asODN和PCEP4-aC后 7d血清HBsAg已有所下降 (P <0 .0 5 ) ;14d时显著下降 (P <0 .0 1) ,且血清HBV -DNA转阴率分别为 66.7% ( 4 /6)和 62 .5 % ( 5 /8) ,而生理盐水组无明显变化。 结论 反义硫代寡核苷酸和反义RNA真核表达质粒均能在乙肝转基因小鼠体内抑制HBV复制和表达 ,且两者在抑制作用上无明显差异性。

核酸疫苗抗原提呈机理研究进展

核酸疫苗即是将外源基因克隆到真核质粒表达载体上 ,然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内 ,使外源基因在活体内表达、产生抗原激活机体免疫系统 ,引起免疫反应。核酸疫苗为疫苗的研制提供了新的方法 ,但其引起的免疫机理尚不十分清楚。本文仅就核酸疫苗不同的免疫方式 ,包括皮内。

DNA疫苗的作用机制及影响因素

DNA疫苗（DNA vaccine）是1990年从基因治疗（genetic therapy）研究领域发展起来的一种全新疫苗，也称核酸疫苗（nucleicacid vaccine）。DNA疫苗是把含有编码某种抗原蛋白的外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组质粒直接导人动物细胞内。并通过宿主细胞的转录系统使外源基因在动物体内表达抗原蛋白，从而诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答．以达到预防和治疗疾病的目的。DNA疫苗可激起机体特异性免疫应答，免疫期长，具有生产成本低。易于大规模生产和保存等优点，是具有应用前景的新一代疫苗。但相对于传统疫苗而言。DNA疫苗所激发的免疫反应强度相对较弱。不足以引起足够的免疫保护效果，尤其对人类以及大动物的免疫试验Ⅲ。因此研究DNA疫苗的作用机制、影响因素对该疫苗的发展应用至关重要。