人miR-155真核过表达载体的构建及其对HepG2.2.15细胞中HBeAg的抑制效应

目的:构建人microRNA-155(miR-155)真核过表达载体,并探讨其对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)的抑制作用,为研究其基因调控机制对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制及免疫状态影响提供实验基础.方法:以人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞基因组为模板,通过PCR扩增人miR-155前体序列,酶切后连接到pmR-mCherry质粒,构建pmiR-155真核过表达载体,然后进行酶切和测序鉴定.利用脂质体将pmiR-155转染HepG2.2.15细胞,同时设空质粒(pmR-mCherry质粒)转染组和空白对照组.转染24 h后荧光显微镜下观察细胞内Cherry表达,RT-PCR检测各组细胞内miR-155表达量以及ELISA法检测HBeAg分泌量的改变.结果:经测序证实,成功构建人pmiR-155真核过表达载体.转染细胞后进行应荧光观察,载体中Cherry有较好的表达活性.RT-PCR表明,与对照组细胞相比,pmiR-155组细胞内所表达的miR-155明显提高.ELISA结果示pmiR-155组细胞所分泌的HBeAg量显著低于空载组和空白组.结论:成功构建了人miR-155真核过表达载体;转染HepG2.2.15细胞后表达稳定;蛋白水平检测表明其可以抑制HepG2.2.15细胞中HBeAg的表达.

鸡的KLF11基因真核表达载体的构建及其在LMH细胞中的表达

KLF11是Kruppel样转录因子家族中的成员,在羧基端具有3个串联的C2H2锌指结构,其在胰腺、肌肉、肝脏等多种组织中广泛表达.本研究采用Trizol法提取鸡肝脏组织总RNA,经RT-PCR方法扩增鸡的LKLF11的CDS区,构建鸡KLF11的重组表达载体;将重组质粒转染至LMH细胞内,Western Blot检测目的蛋白的过表达情况;采用实时荧光定量PCR,检测过表达KLF11基因后对糖脂代谢的相关基因FAS、INS、乙酰辅酶A羧化酶基因(ACC)、PPARγ以及SREBP-1c表达的影响.结果表明,构建的pCMV-3Tag-9-KLF11表达载体,在LMH细胞中成功表达;与空白对照相比,过表达KLF11基因使得LMH细胞中PPARγ的表达量有上升趋势,INS、ACC的表达量有下降趋势,FAS、SREBP-1c的表达量均没有明显的变化.本研究成功实现鸡KLF11在LMH细胞中的过表达,为进一步研究KLF11基因在鸡机体中发挥的功能奠定基础.

P21基因参与早期诱导RUNX1b过表达抑制人类造血发生

目的探究细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1[CDKN1A(P21)]对造血发生过程的影响。方法对RUNX1b诱导过表达hES细胞系(RUNX1b/hESC)与小鼠主动脉-性腺-中肾区(AGM)基质细胞AGM-S3共培养4 d细胞,使用多西环素(DOX)(1μg/mL)与RepSox(0.33μmol/L)或不同浓度DOX(1、0.5、0.2、0.1μg/mL)诱导RUNX1b过表达时,以qRT-PCR技术检测P21与RUNX1b相对表达情况。利用基于转座子载体PiggyBac的PB-tet-on-OE真核诱导过表达系统,建立P21诱导过表达hES细胞系(CDKN1A/hESC)。分别在CDKN1A/hESC与AGM-S3共培养d0、d2、d4、d6添加DOX诱导P21过表达,培养8 d或14 d,通过流式细胞术(FACS)检测血细胞表面分子的变化情况,以判断诱导P21过表达对造血发生产生的影响。结果 qRT-PCR显示:P21表达量随着RUNX1b过表达上调,同时加入RepSox时表达基本处在正常水平,随着DOX浓度降低,RUNX1b与P21表达水平下降。在造血分化的早期,特别是共培养d0开始诱导P21过表达的共培养体系所产生的CD34^-CD43^+、CD34^-CD45^+与CD34^+CD45^+细胞群相较于对照分别降低了85%,94%和78%,当共培养d6后诱导P21过表达上述现象消失。结论 P21可能参与了由RUNX1b诱导过表达所引起的人类早期造血发生的抑制效应;早期诱导P21过表达明显抑制造血细胞产生。

PLC-γ1的多克隆抗体制备及对绵羊早期胚胎发育作用的初步研究

旨在通过构建PLC-γ1真核过表达载体并制备其多克隆抗体,为探索绵羊PLC-γ1基因对卵母细胞激活作用及早期胚胎发育的影响提供基础数据。本研究以实验室保存的Puc57-P2A-Flag-PLC-γ1菌株为模板设计引物并引入HindⅢ、AgeⅠ酶切位点,利用PCR扩增并纯化P2A-Flag-PLC-γ1基因,将其连入pcDNA3.1-EGFP载体,进行转化,通过菌液PCR、双酶切及测序鉴定后提取质粒。随后将构建好的重组质粒转染HEK-293T细胞24 h,分为control组、空载组和PLC-γ1过表达组,通过显微镜观察细胞荧光,实时荧光定量PCR(qPCR)及Western blot(WB)检测转染后细胞中PLC-γ1的表达情况;Anti-Flag免疫磁珠纯化PLC-γ1蛋白;以10月龄的新西兰大白兔(健康状态良好,体重约50 kg,n=2)为对象制备多克隆抗体,间接ELISA法测定多克隆抗体效价,WB鉴定其特异性。通过显微注射重组质粒及离子霉素(Ion)结合6-DMAP孤雌激活卵母细胞,qPCR及WB检测PLC-γ1在卵裂后不同时期(2细胞期、4细胞期、8细胞期、桑椹胚期)的绵羊早期胚胎细胞中的表达情况。结果显示,成功构建真核过表达载体;转染24 h后,与空白对照及阴性对照相比,过表达组PLC-γ1表达量明显升高(P<0.01);WB结果显示成功获得并纯化PLC-γ1蛋白,大小为149 ku;测得PLC-γ1多克隆抗体效价为1∶12 800,并可与PLC-γ1蛋白发生免疫反应。将重组质粒注射到绵羊MⅡ期卵母细胞胞质中,qPCR及WB结果显示PLC-γ1在绵羊早期胚胎发育各时期均有表达。综上所述,本研究成功构建了PLC-γ1真核过表达载体并制备了其多克隆抗体,通过显微注射技术将重组质粒注入卵母细胞并实现表达,证明PLC-γ1在绵羊早期胚胎发育各时期均有表达,且具有作为新的卵母细胞激活因子的潜能。既为探索绵羊PLC-γ1基因对卵母细胞激活作用及早期胚胎发育的影响提供了科学依据,也为进一步提升绵羊的繁殖性能奠定基础。