真皮干细胞与皮肤衰老关系的研究进展

真皮干细胞(dermalstemcells,DSC)是近年在真皮中分离出的一类成体干细胞,在一定条件下可分化为成纤维细胞、骨细胞、脂肪细胞等。其研究主要集中在皮肤组织工程、创伤修复等方面,但有关其在皮肤衰老中的作用还鲜见报道。皮肤衰老主要与真皮成纤维细胞减少、衰老及其生物学特性改变有关,而DSC在一定条件下通过表达细胞因子能激活或分化为成纤维细胞,进而刺激胶原、弹力蛋白等分泌和合成,增强细胞外基质,促进消除皱纹和增加皮肤弹性,为抗皮肤衰老提供新的途径。

不同分化潜能的真皮干细胞膜蛋白初步筛选研究

目的寻找不同分化潜能的真皮干细胞的差异膜蛋白。方法通过选择性地抽提三向分化克隆的细胞膜蛋白,与二向分化克隆进行对比分析,以筛选出与分化能力下降有关的细胞膜相关蛋白。三向克隆与双向克隆的膜蛋白经2-D电泳、质谱分析及Western-Blot检测,初步确认二者之间的明显差异蛋白。结果蛋白质组学分析结果显示,二者的差异蛋白主要有10种膜相关蛋白,其中膜表达差异较显著的蛋白质,如:Annexin A2 isoform1(ANXA2)、Prohibitin(PHB)、Protein disulfide-isomeraseA3(PDIA3),均与细胞分化有关。结论ANXA2、PHB、PDIA3在不同分化潜能的人真皮干细胞膜上表达存在差异,提示了这几组蛋白质参与了该细胞的分化,为初步筛选多潜能真皮成纤维细胞,以及进一步研究其分化的机理提供了重要科学依据和深入探索的新方向。

重组真核表达载体pEGFP-N1/PDGF-A的构建及真皮干细胞的转染

目的克隆血小板衍生生长因子A链(plateletderivedgrowthfactorAchain,PDGFA)基因,以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)载体pEGFPN1为骨架,携带PDGFA基因进入真皮间充质干细胞(dermisdrivedmesenchymalstemcells,DMSCs),为采用转入PDGFA基因的DMSCs修复创面奠定基础。方法采用RTPCR二步分离法,以人肝癌细胞系(SMC7721)的总RNA为模板,扩增PDGFA基因的全长cDNA编码序列,克隆入载体pMD18T,随后又将PDGFA基因亚克隆入pEGFPN1载体中,构建PDGFA基因的真核表达载体pEGFPN1/PDGFA,并采用Fugene6介导转染技术将PDGFA基因导入DMSCs。结果克隆到PDGFA基因的全长cDNA序列,经测序验证,其序列与GenBank所报告的该基因的序列完全一致。结论成功地将PDGFA基因克隆到pEGFPN1载体中,并实现了PDGFA基因在DMSCs的表达。

人sTRAIL基因载体构建及其在真皮干细胞的表达

背景:基于肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor,TNF)可溶性相关凋亡诱导配体(soluble related apoptosis inducing ligand,sTRAIL)抗瘤的生物特性,克隆sTRAIL基因,构建其真核表达载体,为肿瘤细胞凋亡的实验研究奠定基础。目的:构建真核表达载体pEGFP-N1/sTRAIL,并转染真皮干细胞,以探究sTRAIL基因导入真皮干细胞的表达情况。方法:采用RT-PCR二步法,以人胎盘组织总RNA为模板,扩增sTRAIL的cDNA序列,将其克隆入pMD18-T载体,随后亚克隆入载体pEGFP-N1中,构建其真核瞬时表达载体pEGFP-N1/sTRAIL,以Fugene6转染技术,将sTRAIL基因导入真皮干细胞。倒置显微镜下观测转染后真皮干细胞生长变化及sTRAIL在其中的表达等情况。RT-PCR法对目的基因转染的真皮干细胞进行鉴定。结果与结论:克隆到sTRAIL基因的cDNA序列,成功构建了其真核表达载体,该真核表达载体能携带sTRAIL基因在真皮干细胞中正常表达。倒置显微镜下观测到转染后真皮干细胞生长状态与未转染的真皮干细胞无差异。以经sTRAIL基因转染的真皮干细胞该基因组DNA为模板,用RT-PCR法能扩增到sTRAIL基因cDNA序列。

表皮细胞条件培养基对真皮干细胞的影响

真皮干细胞(SKPs)是一种源自真皮,在毛囊再生中发挥关键作用的多能干细胞.然而,SKPs的体外扩增是一项尚未完全解决的难题.该研究结果显示,表皮细胞条件培养基能显著促进SKPs的增殖,增加SKPs特征性基因Akp2,Sox2,Bmp4,Nestin1,PDGFa,Clstn2,Trps1,Versican的表达水平,并提高SKPs毛囊诱导能力标志性蛋白-碱性磷酸酶的活性.因此,该研究提示表皮细胞分泌的蛋白对于SKPs的增殖和干性的维持有重要作用.

胎鼠真皮间充质干细胞对小鼠巨噬细胞极化的影响

目的:探究胎鼠真皮间充质干细胞(Fetal mice dermal mesenchymal stem cells,FDMSCs)对M1/2型巨噬细胞极化的影响。方法:本研究提取FDMSCs,利用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、γ干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)刺激RAW 264.7诱导为M1型巨噬细胞,利用白细胞介素4(Interleukin-4,IL-4)刺激RAW264.7诱导为M2型巨噬细胞,并建立了FDMSCs-RAW 264.7共培养体系。共培养24 h后,收集巨噬细胞,用实时定量PCR和流式细胞学检测M1/2型巨噬细胞特征性因子白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、诱导性一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、CD86、白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)、精氨酸酶1(Arg-1)、CD206的表达变化。结果:FDMSCs使M1型巨噬细胞表达的IL-6、iNOS、CD86减少,IL-10、CD206增多;使M2型巨噬细胞表达的IL-10、Arg-1、CD206表达增多,iNOS表达减少。结论:FDMSCs可以通过调控巨噬细胞极化来调控伤口愈合,对于探索FDMSCs在创面治疗过程中的免疫调节机制有积极意义。

CD34阳性兔真皮干细胞的体外分离培养和鉴定

目的探讨兔真皮干细胞的体外分离培养和鉴定方法，初步对其生长特性进行研究，并为生物组织工程提供一种新的种子细胞及成熟的分离鉴定方法。方法以新生新西兰大白兔为研究对象，机械法直接分离得到真皮组织，采用酶消化法获取细胞，利用干细胞贴壁黏附生长的特性获取高克隆细胞群，并进行传代筛选。应用流式细胞技术检测细胞周期，成骨诱导检测其分化潜能，免疫细胞化学法检测细胞表面分子的表达。结果原代培养的兔真皮细胞经过连续传代培养至第3代。细胞形态均一。流式细胞仪细胞周期分析显示。体外培养3d时DNA合成前期细胞（G1期）为55．8％，DNA合成期细胞（S期）为34．6％。免疫细胞化学显示：细胞表面波形蛋白（vimentin）、CD34表达阳性，细胞角蛋白19（cytoKeratin19）、Ⅷ因子和巢蛋白（nestin）表达阴性。结论新生新西兰大白兔真皮组织中存在多能干细胞，该细胞可向成骨细胞分化，具有多向分化潜能。

两类真皮干细胞的比较

真皮干细胞是一类有广泛应用前景的再生医学种子细胞。按照体外培养细胞形态,真皮干细胞主要有两类,一为贴壁生长的间充质干细胞,二为悬浮生长的皮肤前体细胞。本文就两类细胞的异同与相互关系进行综述,从其分离培养方法、形态学、标志物、分化潜能等方面展开比较讨论。

全身照射大鼠骨髓提取液对真皮多能干细胞趋化作用的实验研究

目的 观察 5Gyγ射线全身照射后大鼠骨髓提取液对真皮多能干细胞 (dermalmultipotentstemcells ,dMSCs)的趋化作用 ,并定量分析尾静脉输注的dMSCs在大鼠体内的分布。方法 在Transwell培养体系中 ,观察骨髓提取液对dMSCs的趋化作用。3H TdR标记dMSCs ,经尾静脉输注到大鼠体内后 ,液闪法测量各组织内dMSCs的含量。结果 Transwell培养体系中 ,照射组骨髓提取液组从上层迁移到下层的细胞明显多于不照射的正常对照组和生理盐水组 (P <0 0 1)。照射后 1周始 ,照射组骨髓dMSCs含量明显高于正常对照组 (P <0 0 1) ;伤后 3周和 4周 ,照射组单位重量骨髓dMSCs含量也明显高于同组的肺脏、肝脏等组织。结论 全身照射大鼠骨髓提取液对dMSCs有很强的趋化作用 ,从而促进静脉输注的dMSCs偏向分布于损伤的骨髓。

创伤早期伤口液对体外培养真皮多能干细胞增殖迁移特性的影响

目的探讨真皮多能干细胞在创伤修复启动中的作用。方法采用前期建立的技术分离、纯化并扩增真皮多能干细胞、真皮成纤维细胞和血管内皮细胞;利用四唑盐比色试验(MTT法)检测不同时间、不同浓度伤口液对上述细胞的影响。在此基础上,观察伤后1d伤口液对真皮多能干细胞贴壁力和迁移力等与创伤修复密切相关的指标变化。结果伤后不同时相不同浓度伤口液对真皮多能干细胞增殖均具有显著刺激作用,但以伤后早期的伤口液作用最为明显。成纤维细胞和血管内皮细胞对伤口液反应均显著弱于真皮多能干细胞。伤口液作用后真皮多能干细胞贴壁力和迁移能力较对照组细胞显著增加。结论真皮多能干细胞是创伤愈合,特别是创伤修复启动过程中的一种重要的间充质干细胞,对其深入研究有望为阐明创伤修复启动分子机制提供依据。

真皮多能干细胞移植后向全身照射大鼠骨髓优势分布的机制研究

目的探讨静脉输注的真皮多能干细胞(dermalmultipotentstemcells,dMSCs)向全身照射(totalbodyirradia tion,TBI)大鼠骨髓优势分布的机制。方法RT PCR和荧光免疫化学检测骨髓中基质细胞源性细胞因子(stromal derived factor1,SDF1)的表达水平,以及dMSCs中SDF1的受体CXCR4的表达水平。Transwell培养体系中,观察SDF1对dM SCs的趋化作用。结果TBI大鼠骨髓SDF1的表达水平明显高于正常大鼠,同时dMSCs表达CXCR4。体外趋化实验发现,SDF1对dMSCs有很强的趋化作用,而使用SDF1的中和性抗体后,TBI大鼠骨髓提取液对dMSCs的趋化作用明显下降(P<0.05)。结论TBI大鼠骨髓局部上调表达的SDF1在移植dMSCs向骨髓的优势分布中有重要作用。

CXCR4腺病毒表达载体的构建及其在真皮多能干细胞中的表达

目的构建大鼠CXCR4的腺病毒表达载体,并观察其转染真皮多能干细胞(dermalmultipotentstemcells,dMSCs)后的表达情况。方法扩增含有CXCR4的全长cDNA,然后亚克隆至穿梭质粒pAdTrackCMV中,再与pAdEasy1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组产生含有CXCR4的骨架质粒(pAdEasy/CXCR4)。将验证正确的pAdEasy/CXCR4用PacⅠ酶切后转染293细胞,从而包装出CXCR4的腺病毒表达载体(AdvCXCR4)。用AdvCXCR4转染dMSCs,并采用RTPCR、免疫荧光细胞化学和荧光激活细胞分类计数的方法检测其表达情况。结果PCR、酶切和测序结果证明,成功地将CXCR4全长cDNA克隆到骨架质粒中,并包装出腺病毒表达载体。同时,AdvCXCR4转染dMSCs后可有效地增加dMSCs中CXCR4的表达。结论CXCR4的腺病毒表达载体的成功构建和其在dMSCs中的表达,为研究CXCR4在干细胞移植中的应用奠定基础。

脊髓损伤后真皮多能干细胞移植时机的选择

目的:观察脊髓损伤后不同时间移植真皮多能干细胞对大鼠运动功能修复的影响。方法:实验于2006-06/2007-03在第三军医大学生理学教研室完成。①实验材料:实验动物2～4月龄SPF级SD大鼠,体质量(210±40)g,雌雄不限,由第三军医大学实验动物中心提供。真皮多能干细胞为第三军医大学防原医学系从SD大鼠真皮中提取和分离。②实验方法:将42只SD大鼠在L4水平制成脊髓全横断损伤模型。将动物随机分为对照组(n=6)、真皮多能干细胞移植组(n=36)。真皮多能干细胞移植组又分为6个时间点:损伤后1,4,7,10,14,21d移植组,每组6只。各移植组于伤处移植大鼠真皮多能干细胞,而对照组于损伤后7d注射等量磷酸盐缓冲液。③实验评估:分别于移植后1d、1周、4周、8周、12周对各组大鼠进行动物行为学和脊髓诱发电位检测。结果:42只实验大鼠均进入结果分析,无脱落。①动物行为学评分:4周以后各组动物行为学评分比较差异有显著性意义(P<0.05),移植组明显高于对照组(P<0.05),各移植组间比较,以损伤后7,10d移植组动物行为学评分改善最显著。②各组大鼠脊髓诱发电位检查:体感诱发电位和运动诱发电位潜伏期和波幅值于移植后8,12周后明显高于对照组(P<0.05),各移植组间比较,以损伤后7,10d移植组体感诱发电位和运动诱发电位潜伏期和波幅值改善最显著。结论:脊髓损伤后7～14d进行真皮多能干细胞移植可明显改善大鼠后肢的运动功能。

hBD_2修饰真皮多能干细胞促进感染创面修复的初步实验研究

目的观察人β防御素2(humanβdefensin2,hBD2)修饰的大鼠真皮多能干细胞(dermalmultipotentstemcells,dMSCs)移植后对细菌感染创面修复的影响。方法制作大鼠全层皮肤切割伤伴感染模型,点状注射的方法将hBD2腺病毒载体转染修饰的dMSCs移植到伤口,通过测定痂下菌量及创面愈合面积百分率和创面愈合时间等评价hBD2修饰的dMSCs局部移植的促愈效果。结果和局部单纯移植dMSCs组和单纯损伤组相比,hBD2修饰的dMSCs移植组痂下菌含量低(P<0.05),且创面愈合时间明显缩短(P<0.05)。结论hBD2修饰的dMSCs可有效地促进大鼠感染创面的修复。

真皮多能干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究

目的:观察真皮多能干细胞(dMSCs)移植对脊髓损伤大鼠运动功能的修复作用。方法:32只SD大鼠在L4水平制成脊髓全横断损伤模型,并随机分为真皮多能干细胞移植组(A组)及损伤对照组(B组),每组10只大鼠。伤后1w,移植组于伤处移植大鼠真皮多能干细胞(dMSCs),而对照组仅注射等量PBS。分别于移植后1d、1w、8w、12w对两组大鼠进行动物行为学(BBB)评分和脊髓诱发电位(SEP和MEP)检测,并于移植后12w进行损伤脊髓的大体观察和组织学检测。结果:BBB评分4w以后组间比较差异有统计学意义(P<0.05),移植组明显高于对照组(P<0.05);SEP和MEP潜伏期和波幅值在8、12w后组间比较差异有统计学意义(P<0.05);移植后12w,移植组损伤脊髓结构的修复明显优于对照组。结论:移植治疗脊髓损伤,能明显改善其运动功能和神经形态,dMSC对脊髓损伤大鼠有治疗作用。

大鼠真皮多能间充质干细胞的分离培养

目的 探讨发育成熟高等动物真皮组织中是否存在多能间充质干细胞 ,对其进行分离培养并初步研究其基本生物学性状。方法 以新生大鼠为研究对象 ,依据间充质干细胞的黏附特性采用酶消化法对其分离 ,通过传代培养进行筛选 ;流式细胞技术检测细胞周期 ,MTT法检测细胞对生长因子的反应性 ,免疫组织化学法检测细胞表面分子的表达。结果 早期贴壁的大鼠真皮细胞经过连续传代培养至第 3代 ,细胞形态较为均一 ,超过 88%的细胞处于G0 /G1期 ,细胞表面波形蛋白表达阳性 ,但Ⅷ因子和角蛋白表达阴性 ;体外培养细胞增殖旺盛 ,对bFGF有良好反应性 ,但对EGF和KGF反应不明显 ;地塞米松诱导分化实验证实该细胞可向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化 ,具有多向分化潜能。结论 本实验证实发育成熟大鼠真皮组织中存在多能干细胞 ,成功地分离得到真皮来源的间充质干细胞并通过其基本生物学特性进行了鉴定。上述结果提示真皮有可能是间充质干细胞的又一重要来源途径。这为深入研究真皮间充质干细胞在组织修复与再生中的意义与应用提供了基础。

真皮多能干细胞在创伤愈合中的作用

目的:研究真皮多能干细胞的部分基本生物学特性,观察其在创伤愈合中的意义。方法:采用前期建立的技术分离、纯化并扩增真皮多能干细胞;利用流式细胞技术观察真皮多能干细胞周期变化;四唑盐比色试验(MTT法)观察其辐射敏感性。收集伤后1,2,3和4d伤口液,观察其对真皮多能干细胞的反应性。结果:分离、纯化的真皮多能干细胞形态较为均一,增殖能力强;培养的细胞凋亡数量少,多处于静止期,对辐射极为敏感;这种细胞增殖对伤口液具有良好的反应性,尤其伤后早期伤口液作用更为明显。结论:发育成熟的个体中仍存在较为幼稚的真皮多能干细胞,它们在创伤愈合过程中具有重要意义,特别是在创伤修复启动中的作用值得进一步深入研究。

重组人Β防御素2在真皮多能干细胞中的表达及抗菌活性的测定

目的检测重组人Β防御素2(HUMANΒ-DEFENSIN2,HBD2)腺病毒表达载体在大鼠真皮多能干细胞(DERMALMULTIPOTENT STEM CELLS,DMSCS)中的表达,并观察重组HBD2的体外抗菌活性。方法将含有HBD2重组腺病毒转染DMSCS,RT-PCR、荧光免疫化学、WESTERN BLOTTING检测HBD2的表达情况,ELISA测定培养上清中HBD2的浓度,K-B纸片扩散法检测上清对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等标准菌株的杀灭效果。结果RT-PCR、荧光免疫化学和WESTERNBLOTTING的结果显示转染后HBD2可在DMSCS中有效地表达,上清中HBD2的浓度为743.6NG/ML,K-B纸片法显示HBD2对上述标准菌株有明显的杀灭效应。结论HBD2重组腺病毒表达载体在DMSCS可高效表达,并对大肠埃希菌等标准菌株有杀灭效应。

白细胞蛋白酶抑制因子在真皮多能干细胞中的表达

目的研究白细胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI)在真皮多能干细胞中的表达以及同伤口液刺激的关系。方法采用前期建立的技术分离、纯化并扩增真皮多能干细胞,收集伤后1d伤口液,比较伤口液刺激前后真皮多能干细胞和创伤前后大鼠皮肤组织中SLPI mRNA表达的变化。通过Western blot了解伤口液刺激前后真皮多能干细胞中SLPI蛋白表达的变化。结果分离、纯化的真皮多能干细胞形态较为均一,增殖能力强,RT-PCR和Western blot提示,SLPI在真皮多能干细胞中表达,伤口液刺激后表达增强。同时检测到SLPI在创伤后1d大鼠皮肤组织中表达升高。结论SLPI高表达可能是真皮多能干细胞参与创伤修复的重要途径之一。

真皮多能间充质干细胞对毛囊生长的影响

目的:了解真皮多能间充质干细胞对毛囊生长的作用及可能的作用机制。方法:去真皮成分毛囊与真皮多能间充质干细胞共同培养,每天检测毛囊的生长长度,以毛乳头细胞及真皮成纤维细胞分别为阳性及阴性对照组,并用免疫组化检测真皮多能间充质干细胞表达的细胞生长因子。结果:在两周内,真皮多能间充质干细胞及毛乳头细胞组毛囊生长净长度分别0.92,0.89mm,而成纤维细胞组为0.29mm;统计学显示干细胞组和毛乳头细胞组之间差异无显著性意义(χ2=1.38P>0.05),与成纤维细胞组之间有明显差异(χ2=7.34P<0.01);免疫组化显示真皮多能间充质干细胞表达肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮细胞生长因子。结论:真皮多能间充质干细胞能支持毛囊的生长,具有毛乳头细胞促进毛囊生长的功能,其作用基础可能与分泌多种细胞生长因子有关。