长白山北虫草鉴定及灵芝真菌免疫调节蛋白基因的转化

选用采自长白山的野生虫草为材料,分离虫草真菌并进行分子生物学鉴定,通过ITS引物扩增和基因序列比对鉴定出4个新的北虫草真菌。用农杆菌介导法将灵芝真菌免疫调节蛋白基因(Fip)转化北虫草,经PCR、Southern等分子生物学检测,灵芝Fip基因已转入北虫草基因组中。

真菌免疫调节蛋白(FIP)结构与功能研究

高等真菌作为免疫调节药物在中医中的应用已有2 000年之久,对其药学功能的研究也一直为学者们所关注.真菌免疫调节蛋白(FIP)是20世纪90年代从灵芝中发现的一类蛋白质,其不仅具有与免疫球蛋白重链可变区相似的结构,而且具有抑制过敏反应、促进核酸和蛋白质合成、加速代谢的功能,能够增强机体的免疫力.就FIP家族蛋白质的发现、结构与功能方面的研究加以论述.

树舌灵芝免疫调节蛋白基因克隆,生物信息学分析及真核表达载体构建

树舌灵芝(Ganoderma applanatum)为灵芝属内独特的一类,克隆树舌灵芝免疫调节蛋白(fungal immunomodulatory protein,FIP)基因,对其进行生物信息学分析并构建真核表达载体,将为高效表达重组树舌灵芝FIP和揭示其生物学功能奠定基础。采用染色体步移的方法从树舌灵芝菌丝体基因组DNA中扩增得到1个新型真菌免疫调节蛋白基因—FIP-gap,对其核苷酸序列进行生物信息学分析,结果表明,FIP-gap基因属于灵芝属FIP家族,含有342 bp,编码113个氨基酸。对其氨基酸序列分析表明:树舌灵芝免疫调节蛋白FIP-gap分子量为12.7 k D,理论等电点为4.93,富含丝氨酸,缬氨酸和苏氨酸,不含组氨酸和半胱氨酸。另外将FIP-gap与其他灵芝属FIP进行蛋白质序列比对分析,其具有FIP典型的保守序列,并与灵芝(G.lucidum)、松杉灵芝(G.tsugae)、紫灵芝(G.japoncium)、紫芝(G.sinensis)、小孢子灵芝(G.microsporum)和黑灵芝(G.atrum)具有78%、78%、78%、79%、78%和77%的同源性,为一新型的FIP。构建灵芝属真菌免疫调节蛋白系统进化树,结果表明树舌灵芝FIP-gap与其他灵芝属FIP均不聚类,说明其与其他灵芝属FIP的亲缘性相对较远。同时,构建了毕赤酵母重组表达载体p PIC9-FIP-gap,为进一步研究FIP-gap的生物学功能提供基础,为全面了解真菌免疫调节蛋白提供理论依据。

大型真菌免疫调节蛋白的研究进展

真菌免疫调节蛋白是一类具有抑菌、抗肿瘤和免疫调节等生物学功能的小分子蛋白质。概述真菌免疫调节蛋白的序列特性、空间结构、生物学功能及调控机理等研究进展,并对其研发的发展趋势进行展望。

黑灵芝免疫调节蛋白基因的克隆和生物信息学分析

黑灵芝(Ganoderma astum)是灵芝家族中一个重要成员,克隆和分析黑灵芝免疫调节蛋白基因,可为进一步了解真菌免疫调节蛋白在种群中的分布打下基础。以黑灵芝为材料,采用同源克隆方法,对真菌免疫调节蛋白(FIPs)基因进行PCR扩增,并对其核苷酸编码序列进行了生物信息学分析。结果表明:黑灵芝真菌免疫调节蛋白基因序列包含336bp,可编码111个氨基酸残基,命名为FIP-gas。FIP-gas分子量为12.4kD,理论等电点为4.80,符合FIPs的特性,是FIPs家族一新成员。对FIP-gas进行序列分析发现其氨基酸序列具有FIPs的保守序列模式,与紫灵芝(G.japoncium)、紫芝(G.sinensis)、小孢灵芝(G.microsporum)、赤灵芝(G.lucidum)、松杉灵芝(G.tsugae)、金针菇(Flammulina velutipes)及草菇(Volvariella volvacea)的FIP序列的同源性分别为99%、98%、87%、86%、86%、61%、55%。系统进化树分析表明黑灵芝的FIP与紫芝的FIP亲缘性最高,与金针菇和草菇的FIP亲缘性相对较远。该研究为进一步了解免疫调节蛋白在灵芝种群中的分布提供了较详细的数据。

真菌免疫调节蛋白的研究进展

真菌免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory protein,Fip)是近年来从一些高等担子菌(蘑菇类)子实体中提取的与植物凝集素和免疫球蛋白的结构和免疫功能相似的一类小分子蛋白质.自1989年Kino等[1]从赤灵芝子实体中分离提取出第一种真菌免疫调节蛋白(LZ-8)以来,目前已分别从赤灵芝,松杉灵芝,金针菇和草菇中的子实体中提取出4种真菌免疫调节蛋白[2-4],它们的氨基酸组分别具有60%～70%的同源性,并且具有相似的免疫生物学活性.根据这4种真菌免疫调节蛋白的氨基酸序列,克隆了这几种蛋白质的编码基因,并将编码基因转入到大肠杆菌或酵母菌中获得了重组免疫调节蛋白的表达[2].本文介绍了这4种真菌免疫调节蛋白的生物学特征、免疫调节活性和分子生物学研究的最新进展.

灵芝免疫调节蛋白基因的克隆和分析

采用同源克隆方法,分别以6个灵芝品种和1个云芝品种的基因组DNA为模板,进行灵芝免疫调节蛋白基因的PCR扩增。扩增产物克隆进T-载体后,进行DNA测序和BLASTn序列分析。结果表明,从赤芝、紫芝、韩芝和甜芝4个菌株中克隆到的PCR扩增片段,含有灵芝免疫调节蛋白基因编码区全长,顺次编号为gimp01,gimp02,gimp03,gimp04。它们已经在国际GeneBank中登记注册,注册号:AY449802,AY449805,AY449804,AY449803。

紫芝免疫调节蛋白基因的原核表达与功能分析

以紫芝(Ganodermasinense)真菌免疫调节蛋白基因(FIP-gsi)为材料,采用原核表达技术进行蛋白表达,利用基质辅助激光解吸附质谱技术(MALDI-MS)鉴定表达的蛋白,通过体外诱导细胞因子表达技术分析细胞因子基因的表达模式,为真菌免疫调节蛋白生物活性及作用机制的研究奠定基础。结果表明:紫芝真菌免疫调节蛋白基因(FIP-gsi)可在原核细胞中表达,表达出的重组蛋白FIP-gsi约占大肠杆菌总蛋白的46.1%;基质辅助激光解吸附质谱技术鉴定显示表达的蛋白为FIP-gsi,与灵芝(G.lucidum)真菌免疫调节蛋白LZ-8有88.6%的一致性;重组蛋白FIP-gsi能够诱导细胞因子IL(interleukin)-2、IL-4、IFN(interferon)-γ,TNF(tumor necrosis factor)-α,LT(lymphotoxin)及IL-2 R(IL-2 receptor)表达,并且呈现一定的剂量关系。

灵芝真菌免疫调节蛋白在体外对不同胃癌细胞的抑制作用

目的通过体外试验测定了3种灵芝免疫调节蛋白(FIP-glu、FIP-gat和FIP-SN15)对26株人胃癌细胞抑制增殖的影响。方法采用MTS比色法检测了3种灵芝免疫调节蛋白对26株胃癌细胞的抑制作用,计算出每种灵芝免疫调节蛋白对不同胃癌细胞50%生长抑制所需的药物浓度值(GI_(50))。结果灵芝免疫调节蛋白加入72 h后,发现3种真菌免疫调节蛋白分别对7株胃癌细胞株NUGC-3、GTL-16、HGC-27、IM95m、SNU-638、SNU-216和SNU-5表现出较强的抑制作用,其GI_(50)<50μg/ml。只对2株胃癌细胞NUGC-4和OCUM-1没有抑制作用。结论灵芝免疫调节蛋白在体外对大多数人胃癌细胞株有较强的抑制作用,3种灵芝免疫调节蛋白的作用趋势相同,有进一步开发成抗胃癌药物的潜力。

血红铆钉菇免疫调节蛋白基因克隆及其生物信息学分析和重组表达

为研究血红铆钉菇中克隆的一种新型真菌免疫调节蛋白基因以及其在毕赤酵母GS115中进行高效重组表达,采用同源克隆的方法从血红铆钉菇菌丝体基因组DNA中扩增得到一个新的真菌免疫调节蛋白基因——FIP-cru,构建FIP-cru真核表达重组载体,并在毕赤酵母GS115中进行FIP-cru重组表达。利用硫酸铵沉淀、琼脂糖镍纳米磁珠纯化目的重组FIP-cru蛋白,采用SDSPAGE和Western blot验证重组FIP-cru表达情况。利用体外血细胞凝集实验与MTT法检测r FIP-cru生物学活性。结果表明:FIPcru属于真菌免疫调节蛋白家族,包含342 bp,编码113个氨基酸,经生物信息学分析发现,FIP-cru与其他真菌免疫调节蛋白有较高的同源性。SDS-PAGE和Western blot检测表明FIP-cru在毕赤酵母GS115中正确重组表达,粗蛋白表达水平为148.5mg·L-1。纯化后的r FIP-cru可以在体外凝集小鼠和羊的血细胞而不凝集人血细胞,MTT法表明r FIP-cru可明显刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖。FIP-cru为一种新型真菌免疫调节蛋白,毕赤酵母高效重组表达的r FIP-cru具有良好的生物学活性。

真菌免疫调节蛋白结构与功能的研究进展

真菌免疫调节蛋白是一类具有多种生物学功能的小分子蛋白质。介绍了已发现真菌免疫调节蛋白的序列特性及结构,并对其生物学功能的最新研究进展进行了综述,最后对其今后的发展趋势进行了展望。

真菌免疫调节蛋白药理学研究进展

综述了近年来真菌免疫调节蛋白(Fungal Immunomodula-tory Protein,Fip)在抗过敏、抗肿瘤、促进小鼠脾淋巴细胞增殖、刺激免疫细胞产生多种细胞因子等免疫药理活性研究进展。为真菌免疫调节蛋白的新药开发与临床应用提供参考依据。

灵芝中真菌免疫调节蛋白LZ-8和LZ-9的比较分析

利用生物信息学方法从蛋白质基本理化特性、蛋白质三维结构以及蛋白表面电荷性质等方面,对灵芝中两种真菌免疫调节蛋白LZ-8和LZ-9进行了预测和比较分析。结果表明:LZ-9蛋白结构柔性较好,N端疏水性更强;利用同源建模构建的LZ-9三维结构模型具有稳定的空间立体结构。比较分析LZ-9与LZ-8蛋白表面静电势能,发现LZ-9中5个突变(R9G、K41Q、D45G、N58D和T89K)改变了蛋白表面静电性质,影响了LZ-9与细胞表面受体的结合,从而产生了与LZ-8不同的生物功能。

免疫球蛋白基因表达的调节

本文主要概述了Ig基因增强子、启动子以及特异性DNA结合蛋白对Ig基因在B淋巴细胞中特异性转录的调节作用。同时也讨论了B淋巴细胞分化过程中所发生的Ig基因转录后调节作用。

Race方法克隆云芝免疫调节蛋白基因

云芝是非常具有应用前景的药用真菌,但是目前关于真菌免疫调节蛋白基因克隆的方法还较少,因此本研究以云芝菌丝体为研究材料,通过Race方法从云芝中克隆出云芝免疫调节蛋白基因,并获得了云芝基因的全序列,通过本研究,以期为药用真菌的克隆方法提供有价值的参考。

金针菇中免疫调节蛋白编码基因FIP-fve的功能

为探究FIP-fve基因在金针菇本体的生物学功能,构建了pCAMBIA1301-pGPD-FIP-fve超表达载体并将其转化至农杆菌LBA4404中,采用农杆菌介导的金针菇转化法,最终获得了FIP-fve基因超表达的金针菇;进行FIP-ve基因沉默(RNAi:FIP-fve)、FIP-fve超表达(pGPD:FIP-fve)和野生金针菇(CK)菌丝体培养和子实体栽培,并记录菌丝体和子实体时期的生物学性状。结果显示:pGPD:FIP-fve金针菇菌丝生长速度最快,CK金针菇次之,而RNAi:FIP-fve金针菇生长速度最为缓慢;子实体出菇栽培后,在子实体数量、菌柄长度、子实体产量和生物学效率方面,pGPD:FIP-fve金针菇都明显优于CK金针菇,而RNAi:FIP-fve金针菇的子实体生长状况最差。研究结果表明,FIP-fve基因能够促进金针菇菌丝体的生长,并对金针菇原基形成具有促进作用,最终影响金针菇的产量。

鹿角灵芝免疫调节蛋白基因的克隆及生物信息学分析

采用同源克隆法,从Ganoderma amboinense 07基因组中成功PCR扩增到编码FIP-gam的全长基因,并进行测序.通过生物信息学分析,可知FIP-gam基因全长333 bp,编码107个氨基酸,理论分子量为12.0 k Da,等电点为4.48.进化树及序列分析结果显示,FIP-gam与灵芝组FIPs同源性较高,而与金针菇、草菇和血红丛赤壳的FIPs同源性较低.采用SWISS-MODEL进行同源建模,结果表明FIP-gam为α-螺旋和β-折叠形成哑铃形的二聚体蛋白.本研究为进一步高效表达FIP-gam及其结构功能关系的研究奠定基础.

白木耳中免疫调节蛋白活性分析与基因扩增的研究

白木耳（Tremella fuciformis Berk）为重要食药用菇类之一，本研究以白木耳干燥子实体为材料，经硫酸铵沉淀及DE-52阴离子交换管柱纯化出具有免疫调节活性的蛋白区分物TFPs，进一步以HiTrap Q阴离子交换层析与胶体过滤层析将TFPs分离出两个蛋白，分别命名为TFP1与TFP2，其分子量分别约为24kDa与40kDa，以等电聚焦电泳分析发现两者的pI值皆为3．45。TFP1和TFP2经过糖蛋白染色试验后。发现两者皆非糖蛋白，经过血球凝集试验后，发现两者皆不具有凝集小鼠缸血球之活性。

LZ-8蛋白的原核密码子优化表达及免疫调节功能的初步检测

为研究LZ-8蛋白的免疫调节活性,设计合成12个寡核苷酸片段,并用PCR方法将它们连接为经密码子优化的新LZ-8基因;将该新基因克隆至原核表达载体pET-28b,构建重组表达质粒pET-28b_lz8,并在大肠杆菌BL21中进行诱导表达.表达产物经Ni离子亲和层析法纯化后,蛋白表达量达70mg·L-1.通过不同品系小鼠的皮肤移植模型检测表明:纯化的重组蛋白具有一定程度的免疫抑制功能,还需进一步实验验证.

细胞凋亡调节基因蛋白表达与前列腺癌的预后

目的 :探讨细胞凋亡调节基因蛋白表达与前列腺癌临床预后的关系。方法 :采用免疫组化染色方法 ,检测 5 7例前列腺癌中Fas及其配体 (FasL)、bcl 2、bax的表达 ,并同前列腺癌临床和病理特征一起 ,先后进行单因素和多因素分析。结果 :bax在前列腺癌低分化肿瘤中的表达强于在高分化肿瘤中的表达 (P <0 0 5 ) ;FasL表达可能对生存预后有一定影响 ,而肿瘤分化程度与临床分期仍是重要的预后指标。结论 :FasL表达可能与前列腺癌预后有关。