MALDI-TOF MS技术在真菌鉴定和药敏试验中的影响因素研究

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种具有经济、快速、准确、高通量等特点的新技术,广泛应用于临床微生物的常规鉴定。近年来,随着MALDI-TOF MS技术的不断发展,其在临床感染性真菌的快速鉴定、药敏试验、分型等实验室诊断中在一定程度上弥补了传统形态学鉴定的不足,展现出巨大的应用潜力。由于真菌种类繁多、结构复杂、耐药谱多样及表型可变,在MALDI-TOF MS技术分析真菌的过程中,影响因素相对来说比较复杂,该文就不同培养条件、蛋白质提取方法和蛋白图谱数据库等条件对MALDI-TOF MS技术鉴定真菌的影响作一综述。

佛山地区甲真菌病感染情况的调查研究

目的研究佛山地区甲真菌病感染情况、菌种类型以及所占比例。方法收集2010年8月至2011年8月到本院皮肤科就诊的657例甲病患者标本,同时对标本进行真菌学检查、培养及鉴定。结果 657例甲病患者中真菌培养阴性426例,阳性231例,阳性率35.2%。阳性菌中酵母菌124例占53.7%,其中白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌分别占25.1%、13.9%、8.7%;皮肤癣菌占41.1%,其中红色毛癣菌、须癣毛癣菌所占比例分别为23.8%、13.4%;霉菌所占比例为5.2%,以曲霉菌和青霉菌为主,分别占3.5%和1.3%,不排除污染。结论佛山地区甲真菌病主要致病菌为酵母菌、其次为皮肤癣菌和霉菌,菌种以白色念珠菌、红色毛癣菌、近平滑念珠菌、须癣毛癣菌和热带念珠菌最多见。

比较重复序列PCR与多位点序列分型技术用于光滑假丝酵母菌的基因分型检测

目的评价REP-PCR基因分型技术在临床光滑假丝酵母菌株分型中的应用价值。方法收集2009-2010年上海瑞金医院、上海仁济医院、上海华山医院、安徽医科大学附属医院、深圳人民医院38株光滑假丝酵母菌。采用MLST法扩增光滑假丝酵母菌的6个管家基因内片段，扩增片段测序后与数据库数据比对得出等位基因谱，从而得到相应的序列型（sequence type，ST）。采用REP-PCR法设计Ca21、Ca22、Corn21引物扩增38株光滑假丝酵母菌重复序列，通过电泳比较分析，获得REP．PCR型。比较两种分型方法的结果和效率。结果以Ca22．Com21为引物的REP-PCR分型效果最好。REP-PCR和MIST分型结果相同，38株光滑假丝酵母菌共产生5种REP-PCR型，分别为A、B、C、D、E型，对应于MIST的S17、ST3、ST19、ST45和新型。REP-PCR比MIST耗时短。结论REP-PCR方法简单快速，且分辨率与MLST技术相同，可作为实验室大量菌株分型的首选方法。

土壤中暗色真菌分离方法的研究

目的寻找经济有效的土壤中暗色真菌的分离方法。方法将一份含有暗色真菌的土壤样品悬液10倍比稀释成4个浓度，并配成含抗生素和不含抗生素2组，8支样品液分别接种于沙氏葡萄糖蛋白胨培养基（SDA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、孟加拉红培养基，各培养基含有0，100，200，300，500mg／L5个浓度的放线菌酮和100万U／L青霉素，50mg／L氯霉素，200mg／L链霉素，分别采用涂布法与倾注法培养，每种培养基共接种80个平皿。结果三种培养基的分离效率分别为：PDA70％，孟加拉红67．5％，SDA3．75％。土壤液稀释100倍和培养基中放线菌酮质量浓度为200mg／L时的分离效率最高，土壤液原液和稀释100倍时分离效率在PDA分别为50％和85％，两组比较，P〈0、05；在孟加拉红培养基分别为45％和85％，两组比较，P〈0．05。各培养基中无放线菌酮和放线菌酮质量浓度为200mcfL时分离率分别为PDA31．25％和87．5％，两组比较，P〈0．05；孟加拉红培养基分别为37．5％和81．25％，两组比较，P〈0．05。样本液中加抗生素和不加抗生素分离率比较，差异无统计学意义。各培养基涂布法与倾注法比较，总的分离率差异无统计学意义，但样品液中不加放线菌酮等抗生素时，倾注法比涂布法分离效率高，PDA分别为80％和40％，孟加拉红分别为80％和30％，各自比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论改良的马铃薯、孟加拉红培养基是适合土壤中暗色真菌分离的培养基，培养基中放线菌酮浓度为200mg／L为最适浓度，采用倾注平板法时方便、经济、有效。

甲真菌病患者多部位红色毛癣菌感染分离株DNA同源性分析

目的 探讨甲真菌病患者多部位红色毛癣菌感染分离株基因型的差异.方法 采用PCR扩增红色毛癣菌rDNA非转录间隔区（NTS）中TRS1片段,并用随机引物OPAA11随机扩增DNA,检测基因多态性.比较同一患者不同感染部位分离菌株的基因型差异.结果 共分离30株红色毛癣菌,按照PCR扩增TRS1区指纹图分为5型,随机引物OPAA11扩增指纹图分为11型,基因型分布与感染部位关系不大.在10例受试患者中,PCR扩增TRS1区显示,7例不同感染部位分离得到的菌株基因型有差异;随机引物OPAA11扩增显示,8例不同感染部位分离得到的菌株基因型有差异.结论 甲真菌病患者不同部位红色毛癣菌感染可能为不同菌株引起,提示部分甲真菌病患者不同部位皮肤癣菌感染可能存在不同菌株的感染.

应用现代化诊断方法提高我国真菌病诊断水平

提高真菌感染的早期、特异诊断水平是目前临床真菌学领域的研究热点，也是临床检验中需要解决的关键问题。除应重视基本方法外，迫切需要发展一些新的诊断手段，如以检测标本中真菌抗原成分和核酸成分为目的的非培养检测技术等。此外，还需要进一步地开展多中心前瞻性研究。应充分发挥真菌实验室的作用，建立规范化的真菌学临床诊断体系，应用现代化诊断方法，提高我国真菌病诊断水平。

医院肺部真菌感染40例临床分析

目的探讨医院肺部真菌感染原因、菌株分布及预防措施。方法回顾性分析40例医院肺部真菌感染患者的临床资料。结果全部患者均有抗生素使用史，使用3种以上抗生素22例（55．0％），使用7种以上抗生素者有5例。使用时间7—65d，平均25．3d。住院期间全程使用抗生素24例（60．0％）。在40例痰培养中分离出真菌59株（白色念珠菌32株、热带念球菌9株、曲霉菌7株、隐球菌2株、毛霉菌2株、放线菌2株、未分型5株）。治愈18例、好转20例、无效2例，有效率95．O％。结论医院肺部真菌感染发病率较高，不合理使用抗生素是其主要原因，有效抗真菌治疗可获得较好的预后。

阴道定植因肯毛孢子菌的分离鉴定

目的报道1例因肯毛孢子菌（Trichosporon inkin）的阴道定植病例并对该菌进行临床实验研究。方法患者女，34岁，阴道分泌物增多伴异味2个月就诊。对其进行临床实验室检查，并对分离菌株进行纯化、玻片小培养鉴定、温度试验、脲酶试验、生化鉴定、体外药敏试验和分子测序基因鉴定等实验研究。结果患者妇科体检阴道内可见乳白色均质化分泌物附着于阴道壁黏膜，阴道分泌物Nugent评分5～6分。两次阴道分泌物培养均分离出淡黄色有皱褶酵母样菌落。该菌在42℃可生长，玻片玉米琼脂小培养见菌丝顶端附着胞形成及典型八叠球菌样结构，最佳生长培养基为酵母菌形态琼脂培养基，脲酶试验阳性，API 20C AUX和分子测序鉴定为因肯毛孢子菌；该菌对两性霉素B和克霉唑、氟康唑等唑类药物敏感，对氟胞嘧啶和卡泊芬净耐药。结论国内首次发现毛孢子菌在阴道内定植，其准确鉴定有赖于表型特征、生化反应及分子测序的综合分析。

湖北地区须毛癣菌复合体的分子鉴定

目的：对分离自患者不同部位的须毛癣菌临床株进行种内分型研究，比较不同靶位对须毛癣菌复合体的鉴定效能。方法选取武汉市第一医院皮肤科近3年临床分离的须毛癣菌48株，经形态学观察和尿素酶试验进行表型鉴定。分别以核糖体DNA（rDNA）的转录间隔区（ITS）和核糖体大亚基（28S rDNA）D1-D2区为靶位，PCR扩增ITS区和D1-D2区后对产物进行测序，联合应用Clustal X2和MEGA 6.0软件，采用最大似然度法进行序列分析并建立遗传进化树。结果 ITS树提示，受试菌株和趾间毛癣菌聚类在同一主支的概率为92%，D1-D2树无法有效区分癣毛癣菌昆克变种和趾间毛癣菌。趾间毛癣菌形态多变，可表现为羊毛型、绒毛型、乳皮型、粉末型和颗粒型。结论 ITS区可将须毛癣菌鉴定到种水平，其鉴定效能优于D1-D2区，形态学方法不能作为其种内鉴定的依据。

DNA芯片鉴定念珠菌种和氟康唑耐药基因ERG11突变

目的建立DNA芯片技术鉴定念珠菌种和氟康唑耐药基因ERG11突变。方法根据6种常见念珠菌内转录间隔（ITS2）区种特异性序列和白念珠菌ERG11基因中已证实可导致对氟康唑耐药的6种突变序列设计探针，制备DNA芯片，鉴定12条50bp的念珠菌种特异性序列和ERG11突变序列及34株念珠菌（其中白念珠菌29株，热带念珠菌、光滑念珠菌、都柏林念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌各1株）。结果①芯片正确鉴定12条人工合成序列；②正确鉴定34株试验菌株的菌种；③正确鉴定29株白念珠菌ERG11基因中可致耐药的已知突变。敏感性和特异性均为100％：结论用DNA芯片进行念珠菌菌种鉴定和白念珠菌ERG11突变筛查，结果可靠。