二十二碳六烯酸对人视网膜色素上皮细胞中血红素氧合酶-1表达的诱导作用

背景 氧化应激是年龄相关性黄斑变性发生的重要机制.研究表明,二十二碳六烯酸（DHA）在视网膜光感受细胞的发育中发挥重要作用,并可上调血红素氧合酶1（HO-1）的表达,从而发挥抗氧化效应,但DHA是否能影响人视网膜色素上皮（RPE）细胞表达HO-1尚未阐明. 目的 观察DHA对体外培养的RPE中HO-1表达的影响及其分子机制. 方法 对人RPE细胞系ARPE-19进行培养,分别用30、50、100和120 μmol/L DHA作用4～24 h,以不含DHA培养的细胞作为对照组.采用乳酸脱氢酶（LDH）法检测DHA对细胞的毒性;分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组细胞中HO-1 mRNA及其蛋白的相对表达;采用比色法分析各组细胞中HO-1酶活性变化情况;采用荧光探针H2DCFDA检测细胞中活性氧簇（ROS）的相对比例,并采用免疫荧光技术检测各组培养细胞中核转录因子-E2相关因子2（Nrf2）的核转位情况;分别采用ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）干预法和Nrf2小干扰RNA（siRNA）转染法作用于培养的细胞,采用Western blot法检测细胞中Nrf2蛋白的表达,并观察其对细胞中HO-1蛋白表达量的影响. 结果 0、30、50、100和120 μmol/L DHA作用于ARPE-19细胞后24 h,培养上清液中LDH漏出率的总体比较差异有统计学意义（F=8.14,P＜0.05）,其中120 μmol/L DHA作用后细胞中LDH漏出率明显高于0、30、50、100 μmol/L DHA组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.不同浓度DHA作用ARPE-19细胞后8h,HO-1mRNA及其蛋白的相对表达量以及HO-1的酶活性总体比较差异均有统计学意义（F=16.24,P＜0.05;F=11.34,P＜0.05;F=11.81,P＜0.05）,其中30、50、100 μmol/L DHA组细胞中HO-1 mRNA及其蛋白的相对表达量以及HO-1的酶活性均明显高于0μmol/L DHA组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.不同浓度DHA作用ARPE-19细胞后4h细胞内ROS相对荧光强度、细胞核Nrf2阳性细胞比例的总体比较差异均有统计学意义（F=11.08,P＜0.05;F=16.42,P＜0.05）,其中30、50和100μmol/L DHA组细胞中ROS相对荧光强度、细胞核Nrf2阳性细胞比例均明显高于0μmol/L DHA组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.100 μ.mol/L DHA处理条件下,NAC预处理后细胞中HO-1蛋白的相对表达量和细胞核Nrf2阳性细胞比例均明显低于单纯100μmol/L DHA组,Nrf2 siRNA转染组细胞中HO-1的相对表达量和细胞核Nrf2阳性细胞比例均明显低于空白siRNA转染组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）. 结论 低于100 μmol/L的DHA可能通过ROS/Nrf2途径诱导RPE细胞表达HO-1,从而发挥对细胞的保护作用.

羟基喜树碱对猪视网膜色素上皮细胞增殖抑制作用的实验研究

目的探讨10-羟基喜树碱(hydroxycamptothecin,HCPT)对培养的猪视网膜色素上皮(retinalpigment epithelium,RPE)细胞的抑制作用,并研究其发挥作用的适宜浓度。方法建立体外猪RPE细胞培养体系,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定对照组及不同浓度(0.75、1.5、3.0、6.0 mg/L)HCPT分别作用第24 h、72 h、120 h时的光密度,计算其对RPE细胞的增殖抑制率;采用流式细胞术检测不同浓度不同时间作用后,各分裂周期RPE细胞的数量;通过倒置相差显微镜和电子显微镜技术观察RPE细胞形态及超微结构的变化,并用台盼蓝排除检测法计算活细胞百分比。结果 0.75 mg/L实验组在HCPT作用后第1天与对照组比较差异无统计学意义;其余各时间段各组与相应对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01);抑制作用与药物浓度、作用时间均呈正相关(药物浓度及作用时间与RPE细胞增殖抑制率呈明显的线性关系)。终浓度为1.5 mg/L的HCPT作用72 h后,RPE细胞的增殖抑制率达47.95%,而细胞活性>85%,细胞形态及超微结构改变轻微,RPE细胞的S期细胞增加了7.52%,G2/M期细胞减少。结论 HCPT对RPE细胞的抑制作用呈剂量-时间依赖性;终浓度为1.5 mg/L的HCPT对RPE细胞的增殖具有明显的抑制作用,且细胞毒性小。

自噬抑制剂3-MA对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

背景糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病常见的并发症之一，视网膜色素上皮（RPE）细胞作为视网膜重要的组成细胞在DR的发生和发展中至关重要。目的探讨自噬抑制剂3-MA对高糖培养的人RPE细胞（hRPECs）增生的影响。方法将体外培养的hRPECs分为对照组、高糖组和3-MA＋高糖组，对照组细胞用含5mmol／L葡萄糖的DMEM／F12培养基进行培养，高糖组采用含30mmol／L葡萄糖的DMEM／F12培养基进行培养，干预组细胞先在DMEM／F12培养基中添加10mmol／L的3-MA处理1h后，再添加30mmol／L葡萄糖溶液进行培养。将培养的细胞以1×10^5／孔的密度接种于24孔细胞培养板中，待细胞80％融合后用含体积分数0．5％胎牛血清的培养基继续孵育24h，使细胞周期同步化。倒置光学显微镜和透射电子显微镜下观察各组jRPECs的形态及超微结构；采用CCK-8法检测各组hRPECs的增生率；采用Western blot法检测各组hRPECs中自噬相关基因微管相关蛋白轻链3B（LC3B）蛋白的表达。结果对照组细胞生长状态良好，细胞排列整齐；高糖组细胞体积稍增大，细胞数量明显多于对照组，而3-MA＋高糖组细胞形态不规则，排列紊乱。透射电子显微镜下可见对照组细胞核呈圆形或卵圆形，亚细胞器形态均正常，未发现自噬小体；高糖组细胞中可见自噬溶酶体，而3-MA＋高糖组可见自噬小体。对照组、高糖组、3-MA＋高糖组细胞的增生率分别为（100．0±2．0）％、（116．9±5．2）％和（103．7±4．7）％，总体比较差异有统计学意义（F=13．526，P=0．006），高糖组的细胞增生率明显高于对照组和3-MA＋高糖组，差异均有统计学意义（均P〈0．05），3-MA＋高糖组与对照组间细胞增生率的差异无统计学意义（P〉0．05）。与对照组比较，高糖组细胞中LC3B—Ⅰ蛋白表达减弱，LC3B-Ⅱ蛋白表达增强，而3-MA＋高糖组细胞中LC3B—Ⅰ和LC3B—Ⅱ蛋白的表达强度与对照组接近。对照组、高糖组、3-MA＋高糖组细胞中LC3B—Ⅱ／LC3B—Ⅰ值分别为0．131±0．065、2．504±0．097和0．274±0．007，组间总体比较差异有统计学意义（F=1694．676，P=0．000），高糖组细胞中LC3B—Ⅱ／LC3B—Ⅰ值明显高于对照组和3-MA＋高糖组，差异均有统计学意义（均P〈0．05），3-MA＋高糖组与对照组间细胞中LC3B—Ⅱ／LC3B—Ⅰ值的差异无统计学意义（P〉0．05）。结论高糖可激活自噬过程并促进hRPECs增生，而自噬抑制剂3-MA在一定程度上抑制自噬进程，从而发挥抑制细胞增生的作用。

姜黄素对人胚胎干细胞向视网膜色素上皮样细胞定向诱导效率的促进作用

背景 来源于多能干细胞的视网膜色素上皮（RPE）细胞移植治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）和视网膜色素变性（RP）是近年研究热点,但RPE体外分化诱导效率低下、成本高等一直是难以克服的障碍.研究表明,姜黄素（curcumin）可促进人胚胎干细胞（ESCs）的定向诱导分化,但其对人ESCs向RPE样细胞的定向分化的作用机制尚不清楚. 目的 研究体外培养的人ESCs向视网膜色素上皮（RPE）样细胞的诱导分化过程,探讨curcumin对人ESCs向RPE细胞定向诱导效率的影响及其机制. 方法 将人ESCs株进行体外培养,将处于对数生长期的ESCs传代至基质膜（Matrigel）包被的6孔板中,以mTeSRTM1培养基培养至过渡融合状态后更换为含质量分数87％ KnockOutTM DMEM、质量分数10％血清替代物（SR）、质量分数1％非必需氨基酸和质量分数1％谷氨酰胺及青链霉素双抗的分化诱导体系,同时加入终浓度为1 μmol/L的curcumin处理24 h,对照组培养基中未加入curcumin.分别于诱导培养3周及5周时提取细胞RNA及蛋白,采用荧光定量逆转录PCR（RT-PCR）法检测诱导RPE（iRPE）细胞中干细胞标志物、RPE相关标志物及Wnt/β-catenin信号通路相关因子mRNA的相对表达水平;采用Western blot法及免疫荧光染色检测人ESCs、iRPE细胞及人RPE细胞中相关标志物蛋白的表达水平;通过细胞吞噬实验检测iRPE细胞的吞噬功能. 结果 Curcumin组诱导后3周时即可见iRPE细胞色素化,随着时间延长色素化程度更高,而对照组细胞在诱导后5周时开始出现细胞色素化.RT-PCR结果显示,curcumin诱导后3周及5周,curcumin组iRPE细胞中ESCs标志物NANOG mRNA的相对表达水平明显低于对照组,差异均有统计学意义（t=13.086,P=0.022;t=34.186,P=0.004）,而RPE标志物Pax6、RX、CRALBP及RPE65 mRNA的相对表达量明显高于对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）.Western blot检测显示,CRALBP、RPE65和MITF蛋白在iRPE细胞中表达,表达强度与人RPE细胞相近,而人ESCs不表达上述蛋白.免疫荧光染色显示,iRPE细胞中Pax6、MITF和ZO-1蛋白表达阳性,分别定位于细胞质和细胞膜,可见curcumin组得到的细胞为iRPE细胞,纯化效率达到100％,体外细胞吞噬实验显示,iRPE细胞的细胞质内呈现的聚苯乙烯荧光微球接近阳性对照组,而阴性对照组iRPE细胞中未见到聚苯乙烯荧光微球.诱导培养后第3周和第5周时,curcumin组细胞中Wnt信号通路下游靶因子Lef1、MYC和TCF7,Wnt受体FZD3及Wnt配体Wnt2B和Wnt7B的mRNA相对表达水平明显高于对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）. 结论 Curcumin能提高人ESCs向RPE样细胞的定向诱导效率,其主要机制可能是通过促进Wnt/β-catenin信号通路的活性,从而促进iRPE细胞的分化和成熟。

内质网应激对光照诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的促进作用

背景视网膜色素上皮（RPE）细胞的光损伤模型是多种视网膜变性类疾病的研究工具，光诱导RPE细胞损伤的主要病理基础是凋亡及炎症反应，但是内质网应激（ERS）反应是否参与其病理机制的研究国内外少有报道。目的探讨ERS对光损伤诱导的人RPE细胞凋亡的作用及其机制。方法体外培养人RPE细胞株（ARPE-19），将培养的细胞分为正常对照组及光照3、6、12和24h组，各光照组在培养箱内以（2000±500）lx的白色荧光灯光照细胞建立光损伤模型，正常对照组细胞在暗环境中培养且不给予光照射，筛选实验最适光照时间。将细胞分为正常对照组、光照组（光照12h）和苯基丁酸（4-PBA）预处理＋光照组，4-PBA预处理＋光照组先用ERS抑制剂4-PBA培养细胞30min，然后光照细胞12h。采用流式细胞仪检测各组人RPE细胞的凋亡率和细胞内活性氧（ROS）的荧光强度；采用ELISA法检测各组细胞上清液中炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）质量浓度；分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测人RPE细胞中ERS标志物活化转录因子-6（ATF-6）、C／增强结合蛋白同源蛋白（CHOP）和细胞凋亡标志物半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（caspase-12）mRNA及其蛋白的表达。结果光照后细胞形态呈长梭形改变，边界不清，细胞质脱颗粒，细胞碎片增多，且随光照时间的延长而加重。流式细胞仪检测发现，随光照时间的延长，人RPE细胞内ROS含量逐渐增加，细胞凋亡率逐渐升高，差异均有统计学意义（F=763．00、119．30，均P〈0．01）。ELISA法检测发现，与正常对照组比较，光照后6h细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显升高，12h达峰。实时荧光定量PCR和Westernblot检测显示，与正常对照组比较，光照后人RPE细胞中ATF-6、CHOP和caspase．12 mRNA及其蛋白的相对表达量均明显升高，均于光照后12h达峰或升高，故选择光照12h为最适光照时间作为后续研究。4-PBA预处理＋光照组细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA的相对表达量均明显低于光照组，差异均有统计学意义（F=281．69、473．88、308．45，均P〈0．01）；ATF-6、CHOP和caspase-12蛋白的相对表达量均明显低于光照组，差异均有统计学意义（F=47．86、57．93、106．59，均P〈0．01）；细胞凋亡率、细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显低于光照组，差异均有统计学意义（F=88．64、245．47、101．ol，均P〈0．01）。结论（2000±500）lx的光照可诱导人RPE细胞内ROS增加，并激活细胞的ERS反应，导致RPE细胞凋亡及炎症反应。ERS抑制剂4-PBA可抑制光损伤导致的ERS反应，进而降低RPE细胞凋亡率并抑制炎症反应过程。

玻璃体腔重复注射雷珠单抗对新生血管性AMD视网膜色素上皮萎缩面积及脉络膜厚度的影响

背景玻璃体腔注射雷珠单抗（IVR）是治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性（nAMD）的有效方法，了解IVR对视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜产生的可能影响有助于临床上更好地选择重复注射次数和时机。目前对nAMD患者接受IVR后RPE萎缩面积和脉络膜厚度变化的定量研究较少见。目的采用频域光相干断层扫描（OCT）技术探讨IVR对nAMD患眼RPE萎缩面积及脉络膜厚度的影响。方法采用前瞻性自身对照研究设计，连续纳入2015年1月至2015年6月在武汉大学人民医院就诊的nAMD患者41例41眼。所有患眼均接受0.05 ml雷珠单抗（10 mg/ml）玻璃体腔注射，每个月随访1次，连续随访12个月。分别于IVR前及IVR后3、6、12个月采用频域OCT仪中RPE高级定量分析软件测量患眼黄斑区RPE萎缩面积，采用加强深度扫描OCT（EDI-OCT）技术测量黄斑中心凹下脉络膜厚度，对比分析IVR前后RPE萎缩面积和脉络膜厚度的变化及其之间的关系，评估RPE萎缩面积和脉络膜厚度变化与IVR次数的相关性。结果所有患者全部配合完成治疗和随访。IVR后患眼视力较IVR前均明显改善，注射前后不同时间点平均视力的总体比较差异有统计学意义（F＝7.631，P〈0.001）。患眼IVR注射前平均脉络膜厚度值为（264.55±100.95）μm，IVR后3、6、12个月分别为（247.42±105.46）、（246.81± 99.85）和（253.97±101.15）μm，注射前后患眼平均脉络膜厚度值的差异有统计学意义（F＝2.030，P〈0.05），注射后各时间点患眼平均脉络膜厚度较注射前均明显变薄，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。患眼IVR前与IVR后各时间点平均RPE萎缩面积比较差异无统计学意义（F＝0.116，P＝0.951）。患眼RPE萎缩面积减小值与脉络膜厚度降低值呈微弱负相关（r＝－0.185），注射次数〉6次组和注射次数≤6次组患眼的RPE萎缩面积减小值和脉络膜厚度降低值间分别呈微弱正相关和负相关（r＝0.297、－0.327），但均无统计学意义（P＝0.248、0.282、0.103）。随访12个月，RPE萎缩面积减小值和脉络膜厚度降低值与IVR次数均呈微弱的线性相关（rs ＝－0.266、0.342），但均无统计学意义（P＝0.148、0.060）。结论IVR可使AMD患者中心凹下脉络膜萎缩变薄，但未发现引起明显的RPE萎缩。多次IVR并不加速RPE或脉络膜萎缩。

MMPs抑制剂GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ及Ⅱ对人晶状体上皮细胞移行的抑制作用

背景 白内障术后残留晶状体上皮细胞（LECs）的增生、移行、上皮-间质转化等生物学行为与晶状体后囊膜混浊（PCO）的发生有关,基质金属蛋白酶（MMPs）参与细胞的移行过程.广谱MMPs抑制剂GM6001能抑制人LECs的移行,但特异性MMPs抑制剂,即MMP-2/9抑制剂Ⅰ和Ⅱ对LECs移行能力的影响及药物的安全性尚不明确. 目的 比较GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ和MMP-2/9抑制剂Ⅱ对LECs移行的抑制作用及其对细胞活性的影响.方法 对人LECs系进行培养和传代,取传至3～4代的细胞培养于6孔板中,当细胞生长融合至70％后改用无血清培养液作用12h,在培养液中分别加入不同浓度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00、64.00、128.00μmol/L）GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ和MMP-2/9抑制剂Ⅱ,以基础培养液培养的细胞作为对照组,用200μl无菌枪头在细胞层中划出细胞裸露区,继续培养后24 h计算各组细胞移行的平均距离,计算各种药物对LECs移行的抑制率.在细胞活性的测定中,取传至第2代或第3代LECs,调整细胞密度至5＆#215;105/ml,以200 μl/孔接种至96孔板常规培养,分别加入128.00 μmol/LGM6001、64.00μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅰ和32.00 μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅱ,以基础培养液培养的细胞作为对照组,培养24 h后用MTT法测定吸光度（A）值,分析并比较3种药物对LECs活性的影响,评估药物对细胞的毒性作用.结果 正常培养的LECs生长良好,贴壁生长的细胞呈梭形或多边形,排列不规则.随着GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ和MMP-2/9抑制剂Ⅱ浓度的增加,LECs移行距离逐渐缩短,总体比较差异有统计学意义（GM6001：F=248.647,P＜0.05;MMP-2/9抑制剂Ⅰ：F=357.125,P＜0.05;MMP-2/9抑制剂Ⅱ：F=396.374,P＜0.05）.将对照组细胞移行距离设为1,3种药物浓度为32.00 μmol/L时,GM6001组、MMP-2/9抑制剂Ⅰ组和MMP-2/9抑制剂Ⅱ组细胞的相对移行距离分别为0.478±0.091、0.294±0.088和0.191±0.081,总体比较差异有统计学意义（F=116.031,P＜0.01）,其中MMP-2/9抑制剂Ⅱ组中细胞移行距离明显低于GM6001组和MMP-2/9抑制剂Ⅰ组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）.对照组、128.00 μmol/L GM6001组、64.00 μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅰ组和32.00 μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅱ组的A值分别为0.607±0.016、0.567±0.015、0.583±0.010和0.595±0.014,总体比较差异无统计学意义（F=1.403,P＞0.05）. 结论 3种MMPs抑制剂均可有效抑制体外培养的LECs的移行,且对细胞的生长活性无明显影响,其中MMP-2/9抑制剂Ⅱ的抑制作用最强。

阴离子交换蛋白阻滞剂DIDS对人视网膜色素上皮细胞非特异性吞噬过程的影响

目的:探讨阴离子交换蛋白在人视网膜色素上皮(RPE)细胞非特异性吞噬过程中的作用。方法:体外培养人RPE细胞,以荧光包被的乳胶株作为吞噬标记物,建立RPE细胞吞噬模型。使用不同浓度阴离子交换蛋白阻滞剂DIDS(1、10、100、200、300、500和1000μmol·L-1)预处理RPE细胞,37℃孵育6h,利用流式细胞术定量检测RPE细胞对乳胶珠的吞噬指数。结果:经6h孵育,未加DIDS的对照组RPE细胞对乳胶株的吞噬指数为(35·1±1·6)%,加入1μmol·L-1DIDS的RPE细胞吞噬指数为(34·1±2·1)%(P>0·05),加入10μmol·L-1DIDS的RPE细胞吞噬指数为(28·7±1·9)%,10μmol·L-1的DIDS显著地抑制了RPE细胞对乳胶株的吞噬作用(P<0·05),并且随着DIDS浓度的增加(100、200、300、500及1000μmol·L-1),RPE细胞吞噬指数逐渐降低[吞噬指数分别为(23·0±1·2)%、(17·0±1·5)%、(12·0±1·6)%、(7·0±2·2%)及(5·0±2·5)%],与对照组比较差异均有显著性(P<0·01)。结论:抑制阴离子交换蛋白的活性将导致人RPE细胞非特异性吞噬功能的障碍,阴离子交换蛋白可能参与人RPE细胞的非特异性吞噬过程。

灵芝对鸡胚视网膜色素上皮细胞影响

选用孵育24 h 的来亨鸡胚,注入灵芝液0.4 ml,继续孵育到第4～6天取眼球和卵黄囊做成石蜡切片,HE 和 HEA Ⅱ(苏木精-伊红-天青Ⅱ)染色。结果显示:灵芝液对鸡胚无致畸作用,对视网膜色素上皮细胞的色素颗粒的形成有促进作用。

曲安奈德对体外人视网膜色素上皮细胞增生的影响

目的探讨曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)对人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelium,ARPE-19)增生的影响。方法采用MTT比色法测定终质量浓度为10、303、00 mg/L TA分别作用于ARPE-19细胞24 h和72 h后的吸光度A值。结果不同药物浓度TA对ARPE-19增殖的抑制作用差异有显著性(F0.05,3,16=3.24,P<0.05);此外,TA作用时间对ARPE-19增生的影响显著(F0.05,1,16=4.49,P<0.05);而且TA药物浓度和作用时间之间相互影响,对ARPE-19细胞增殖的抑制作用具有显著性意义(F0.05,1,16=4.49,P<0.05)。结论TA能够抑制视网膜色素上皮细胞的增殖,有望成为增殖性玻璃体视网膜病变的治疗药物。

无动物源性成分培养体系快速诱导人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化

背景 随着视网膜色素上皮（RPE）细胞视网膜下腔移植治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）研究的开展,需要优化无动物源性成分（xeno-free）培养体系快速定向诱导人胚胎干细胞（hESCs）向RPE细胞分化以满足日渐增长的科研及临床需要. 目的 建立xeno-free培养体系,优化快速诱导hESCs向RPE细胞分化的方法. 方法 将hESCs克隆团接种至Vitronectin XFTM,在培养液中加入50 ng/ml noggin、10 ng/ml DKK-1以及10 ng/ml胰岛素样生长因子-1（IGF-1）培养2d,第2～4天将培养液中noggin质量浓度减至10 ng/ml,并加入5 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）,第4～6天移除培养液中的noggin和bFGF,第8～14天培养液中加入1 μmol/L CHIR99021.倒置显微镜下观察ESCs在分化为RPE细胞过程中的形态变化,免疫荧光染色检测细胞内特异性抗原的表达以对分化细胞进行鉴定,实时荧光定量PCR （qRT-PCR）法检测细胞分化过程中RPE细胞特异性蛋白mRNA的相对表达变化量.结果 分化培养第14天,部分细胞呈多角形并呈现铺路石样排列,且细胞内可见色素颗粒;培养第35天,诱导分化的细胞内表达RPE细胞特异性抗原Mitf及RPE65;培养至第60天,细胞内富含黑色素颗粒且呈规则六边形.与诱导分化前比较,诱导分化第7天和第14天hES-RPE细胞中Mitf mRNA的表达量分别增加了（3.43±2.77）倍和（8.91±2.83）倍,而RPE65 mRNA的表达量分别增加了（14.60±3.94）倍和（87.16±9.32）倍,分化第7天和第14天细胞中的Mitf mRNA和RPE65mRNA的相对表达量均明显高于分化前,差异均有统计学意义（均P＜0.05）. 结论 hESCs可在含尼克酰胺、DKK-1、noggin、IGF-1和CHIR99021的xeno-free优化培养体系中快速分化为RPE细胞.

姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞中核因子-κB相关炎性因子表达的抑制作用

背景白细胞介素-1β（IL-1β）是增生性玻璃体视网膜病变（PVR）早期释放的重要炎性因子，研究证实姜黄素能抑制IL-1β诱导的兔视网膜色素上皮（RPE）细胞的增生，但其是否能够对PVR发挥抗炎作用尚不清楚。目的观察姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞移行的影响，探讨姜黄素对IL-1β诱导的RPE细胞中炎性因子表达的影响。方法采用对数生长期原代培养的第4代兔RPE细胞进行实验，在无血清DMEM培养基中分别添加0、0．1、1．0和10．0μg／L的IL-1β作用于细胞24h，分别采用Western blot和逆转录PCR法检测细胞中环氧合酶-2（COX-2）蛋白和mRNA的表达以筛选IL-1β最佳质量浓度。将培养的RPE细胞分为IL-1β组和姜黄素＋IL-1β组，分别在无血清培养基中添加1．0μg／L IL-1β和1．0μg／L IL-1β联合10μg／ml姜黄素作用于细胞24、48和72h，仅用无血清培养基培养的细胞作为对照组。培养的细胞行苏木精-伊红染色，于光学显微镜下计算进入损伤区的细胞数，比较各组细胞的移行能力；分别采用Western blot法和逆转录PCR法检测各组RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量，采用Westernblot法检测并比较各组细胞中核因子-κB p65（NF—κB p65）蛋白和核因子κB抑制蛋白-α（IκB—α）的相对表达量；采用免疫化学染色法检测NF—κB p65、IκB-α和COX-2在各组RPE细胞中的表达和定位。结果初分离的兔RPE细胞呈球形，细胞中可见大量黑色素颗粒；第4代细胞色素颗粒明显减少，接近融合的细胞形态为长梭形，呈拉网状分布。免疫细胞化学染色法结果显示，细胞角蛋白（AE1／AE3）在细胞质呈阳性表达。对照组在培养24、48和72h移行的细胞数分别为（31．93±1．21）、（36．27±2．50）和（38．33±2．40）个，IL-1β组分别为（45．73±2．30）、（71．13±1．92）和（80．60±1．71）个，而姜黄素＋IL-1β组分别为（13．13±2．20）、（14．93±1．10）和（12．60±1．51）个，各时间点IL-1β组细胞移行细胞数均明显高于对照组，而姜黄素＋IL-1β组移行细胞数均明显低于对照组和IL-1β组，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。IL-1β质量浓度为1．0μg/L时，RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量达峰，以1．0μg／L IL-1β的剂量进行后续实验。细胞培养后24、48和72h，姜黄素＋IL-1β组细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量均明显低于IL-1β组，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。IL-1β作用于细胞后48h，细胞中NF—κB p65蛋白的相对表达量最高，与IL-1β组相比，各时间点姜黄素＋IL-1β组细胞中NF—κB p65蛋白相对表达量降低，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。IL-1β组药物作用于细胞后48h细胞中IκB—α降至最低，各时间点姜黄素＋IL-1β组细胞中IκB-α值均明显高于IL-1β组，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。免疫细胞染色结果显示，IL-1β组RPE细胞的细胞核及细胞质中NF—κB p65呈强阳性表达，对照组表达较弱，姜黄素＋IL-1β组细胞中NF—κB p65的表达强度较IL-1β组明显降低；与对照组相比，IL-1β组细胞的细胞质中IκB-α表达强度明显减弱，而COX-2表达明显增强；与IL-1β组比较，姜黄素＋IL-1β组细胞中IκB-α表达明显增强，而COX-2表达明显减弱。结论姜黄素可抑制IL-1β引起的兔RPE细胞的移行，IL-1β通过激活NF—κB信号通路刺激细胞中COX-2的表达，姜黄素可通过阻断这一途径而抑制炎性因子的表达，从而发挥抗炎作用。

激光光凝眼底联合卵磷脂络合碘片治疗中心性浆液性脉络膜视网膜病变的临床研究

中心性浆液性脉络膜视网膜病变（CSC）是较为常见的眼底病变,可导致患者的视力下降、视物变形,严重时可引起患者视觉功能的不可逆损伤。中心性浆液性脉络膜视网膜病变主要是由于后极部色素上皮屏障功能损伤,引起视网膜浆液性脱离、色素上皮渗漏而出现一系列的临床症状[1]。部分患者可自愈,其病程多在3个月至半年甚至更长。病程长的患者视功能不能完全恢复正常[2]。

外用dorzolamide可降低眼内压

伦敦消息:一个有40年药龄的外用药物可以缓解150,000名加拿大开角青光眼患者的痛苦。盐酸dorzolamide滴眼液(一种碳酸酐酶抑制剂,CAI)是一种新型滴眼剂。它能阻止非色素性睫状体上皮产生某种酶,这种酶间接影响眼房水的产生,此房水导致了眼内压的升高。西安大略大学的医学副教授、伦敦健康科学中心眼科专家David Tingey博士称。

姜黄素对兔视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的探讨姜黄素对兔视网膜色素上皮（RPE）细胞增生的抑制作用及其作用机制。方法选取第4代RPE细胞进行实验，分为姜黄素组和空白对照组，姜黄素组设10、15、20μg／ml 3个质量浓度。噻唑蓝比色（MTT）法检测姜黄素10、15、20μg／ml分别在24、48、72、96h对体外培养的RPE细胞增生的抑制率。线性回归分析计算各时间段的半数抑制率（IC50）剂量。流式细胞仪（FMC）检测姜黄素15μg／ml作用72h后对RPE细胞周期的影响，并且检测姜黄素15μg／ml作用24、48、72h后RPE细胞增生细胞核抗原（PCNA）的表达量和凋亡率。透射电子显微镜进行RPE细胞形态学检测。结果姜黄素24、48、72、96h的IC50分别是29．31、17．50、13．24、10．99μg／ml。姜黄素使RPE细胞阻滞在G0／G1期。姜黄素15μg／ml作用24、48、72h后，RPE细胞的PCNA表达量分别为（565．04±23．60），（473．61±36．88），（396．15±32．45），凋亡率分别为（12．83±0．13）％，（32．27±4．51）％，（56．81±8．67）％，各浓度组与对照组相比，差异均有统计学意义（P〈0．05）。透射电子显微镜显示RPE细胞出现凋亡特征。结论姜黄素可以影响RPE细胞的PCNA合成，诱导其凋亡，从而有效抑制RPE细胞增生。姜黄素有望成为一种有效的防治PVR的天然药物。

老龄多巴色素异构酶敲除小鼠视网膜色素上皮细胞中黑色素在视网膜光损伤过程中的作用

目的 观察视网膜色素上皮（RPE）细胞中黑色素含量与光感受器细胞功能之间的关系，探讨黑色素对视网膜光损伤的作用。方法 老龄多巴色素异构酶敲除小鼠（Dct-/-小鼠）和C57BL/6小鼠（野生型小鼠）各20只，分别为Dct-/-小鼠组和野生型小鼠组。采用临床电生理国际标准分别对各型鼠进行视网膜电图（ERG）检查，记录其最大混合反应后各组随机处死2只小鼠，摘除眼球作为阴性对照。余下每组各18只小鼠，将6只小鼠用20 W冷荧光灯行12 h明、12 h暗、12 h明的间断光照36 h，连续3个循环。光照强度为（5000±356） lx。光照结束后第6天再次进行ERG检查，记录ERG结果。随机颈椎脱臼法处死每组各2只小鼠，摘除眼球。所有摘除眼球常规组织切片，光学显微镜、电子显微镜观察。结果 ERG检查结果显示，光损伤前后Dct-/-小鼠a、b波振幅明显低于野生型小鼠（ta波光照前=-7.13，P〈0.01；tb波光照前=-4.414，P〈0.01；ta波光照后=-10.162，P〈0.01；tb波光照后=-6.772，P〈0.01）；光损伤后Dct-/-小鼠ERG a、b波的振幅下降幅度明显高于野生型小鼠（ta波=4.975,P〈0.01；tb波=2.908,P〈0.01）。光损伤后，光学显微镜检查可见Dct-/-小鼠视网膜水肿、变薄，较野生型明显；电子显微镜检查可见RPE细胞中黑色素颗粒融解、断裂或丢失，光感受器细胞外节盘膜肿胀、碎裂及空泡变，Dct-/-小鼠损伤较野生型小鼠严重。结论 光损伤后RPE细胞黑色素含量减少，光感受器细胞功能下降，提示黑色素对光损伤可能有保护作用。

促红细胞生成素对人视网膜色素上皮细胞氧化损伤保护作用及其机制

目的 观察促红细胞生成素（EPO）对人视网膜色素上皮（hRPE）细胞抗过氧化氢（H2O2）损伤的影响。方法以传代培养hRPE细胞为研究对象，采用800μmol／LH2O2作用3h建立hRPE细胞损伤模型，分为正常对照组、单纯损伤组、重组人EPO（rhEPO）治疗组。治疗组又根据加入rhEPO浓度不同分为10、20、40、60IU／ml亚组。免疫组织化学方法检测细胞中核因子kappaB（NF—kB）的活化情况，比色法测定细胞脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量及乳酸脱氢酶（LDH）细胞释放率。结果H2O2可使培养液中MDA及LDH释放率上升，单纯损伤组与正常对照组相比，差异有统计学意义（tLDH=29．746，tMDA=20．426，P〈0．05）；各治疗组与单纯损伤组比较，MDA及LDH释放率均有显著降低，差异有统计学意义（t10IU=5．770，t60IU=12．774，t40IU=19．818，t60IU=24．833，P〈0．05；MDAt10IU=5．345，t20IU=10．278，t40IU=18．571，t60IU=20．247，P〈0．05）；各治疗组相关分析显示，rhEPO浓度与LDH细胞释放率及MDA含量呈负相关（r=-0．976，P=0．024；r=-0．968，P=0．032）；rhEPO浓度与NFxB核移位率呈正相关（r=0．998，P=0．002）；NF—kB核移位率与MDA含量呈负相关（r=-0．954，P=0．046）。结论EPO能有效地拮抗H2O2对hRPE细胞的脂质过氧化损害，其机制可能与活化NF—kB有关。

细胞内Ca^2＋及MERTK基因在人视网膜色素上皮细胞吞噬功能中的作用

目的观察细胞内Ca^2＋及MERTK基因在人视网膜色素上皮（RPE）细胞的吞噬功能中所起的作用及二者的相互关系。方法用视细胞外节膜盘（ROS）于37℃孵育培养的RPE细胞，在孵育不同终止吞噬反应。双重荧光标记法检测RPE细胞吞噬动力学；钙离子荧光探针负载法在荧光显微镜下测定RPE细胞内Ca^2＋的变化；半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测相应时间点MERTK基因表达的变化及施加Ca^2＋激活剂（A23187载体）或拮抗剂（verapamile）后MERTK基因表达的变化。结果RPE细胞与ROS孵育过程中，ROS结合于RPE细胞表面发生在15min时，RPE细胞吞噬ROS在24h时达到饱和。细胞内Ca^2＋在孵育15min时升高，并在24h内保持高水平；MERTK基因表达在RPE细胞与ROS孵育5min时增强，并在全部孵育过程中呈现出高表达状态；以A23187载体开放钙通道升高RPE细胞内Ca^2＋后，MERTK基因信使核糖核酸（mRNA）水平升高，并呈剂量依赖性。经A23187预处理后的孵育实验中所检测到的MERTK mRNA水平除3h这一时间点外均高于对照组；verapamile拮抗RPE细胞内Ca^2＋后，MERTK基因表达明显下降并呈剂量依赖性；以verapamile预处理后继续与ROS孵育，所检测到的MERTK基因在24h内均低于对照组。结论MERTK基因及细胞内Ca^2＋发挥着维持RPE细胞吞噬过程的重要作用，MERTK作为上游调控信号启动下游的细胞内Ca^2＋信号来维持RPE细胞对ROS的摄入过程。

双眼玻璃膜疣性色素上皮脱离一例

患者女．60岁。因双眼视物模糊、视物变形8个月，于2015年1月4日就诊于我科。患者8个月前因过度疲劳出现双眼渐进性视力下降，伴有视物变形，就诊于我院门诊，诊断为：“双眼黄斑水肿”，给予羟苯磺酸钙等药物口服后症状无好转。既往高血压病史2年，平素口服马来酸左旋氨氯地平2．5mg/d，血压控制于130／80mmHg；子宫肌瘤切除术后12年；胆结石病史20年。

细胞因子对人视网膜色素上皮细胞syndecan-1表达的影响

目的检测细胞因子对人视网膜色素上皮(RPE)细胞syndecan-1表达的影响,并探讨其作用的信号转导途径。方法体外培养人RPE细胞,采用逆转录聚合酶链反应和免疫荧光法检测正常细胞syndecan-1mRNA、蛋白的表达;免疫荧光法定性、定量观察不同刺激因子作用下syndecan-1的表达变化,包括:7、35ng/ml肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激24h,1、6μg/ml脂多糖(LPS)刺激11h,7ng/mlTNF-α刺激不同时间(0～24h,每2h为1个时间点,共13个时间点),30%单核/巨噬细胞株(THP-1细胞)上清液刺激3、14、43h;细胞外信号调节激酶(ERK)1/2通路特异性阻断剂PD098059预处理2h后对30%THP-1细胞上清液作用的调节;30%THP-1细胞上清液刺激细胞3h后0.25%胰酶作用5min,噻唑蓝法检测细胞贴壁情况。结果在正常RPE细胞中可检测到syndecan-1mRNA和蛋白的表达;未受刺激的RPE细胞细胞膜、细胞浆及核仁呈强的黄绿色荧光,细胞核呈浅绿色荧光;随TNF-α、LPS浓度及时间增加,荧光强度呈减弱趋势(P<0.01);30%THP-1细胞上清液刺激后细胞荧光强度明显减弱(P<0.001)。50μmol/LPD098059预处理2h后可部分阻断30%THP-1细胞上清液的下调作用。与对照组相比,THP-1细胞上清液作用3h后贴壁细胞数下降(P<0.05)。结论TNF-α和LPS可下调体外培养的人RPE细胞syndecan-1的表达;30%THP-1细胞上清液可下调RPE细胞syndecan-1的表达、促使细胞脱壁,且该作用至少通过了ERK1/2信号转导通路。