胃癌组织P27、MMP-9和PEDF蛋白表达及意义

目的:探讨P27、MMP-9和PEDF蛋白表达在胃癌发生发展中的作用。方法:应用免疫组织化学法检测82例人体胃癌组织标本中胃癌细胞内P27、MMP-9和PEDF的表达;统计学分析上述各分子标记物与胃癌临床病理因素间的关系。结果:(1)82例正常胃黏膜均有P27、PEDF表达,在胃癌组织中的表达率分别为48%和43%。MMP-9在胃癌中表达率为70%,正常胃黏膜呈阴性表达。(2)P27低表达与胃癌组织学分级和远处转移有关(P<0.05);MMP-9高表达与浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关(P<0.05);PEDF低表达与组织学分级、浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关(P<0.05)。结论:胃黏膜上皮细胞在癌变过程中P27和PEDF表达降低,而MMP-9表达升高;MMP-9在胃癌侵袭转移中起促进作用,P27和PEDF可抑制胃癌的进展。

脂质体介导色素上皮衍生因子-绿色荧光蛋白质粒转染大鼠视网膜细胞及其转染途径的实验研究

目的观察表达质粒色素上皮衍生因子（PEDF）-绿色荧光蛋白（GFP）以脂质体介导转染入BN大鼠视网膜组织的表达及定位，探索合适的基因治疗给药方法。方法将脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP分别经玻璃体注射和视网膜下注射的途径转染至BN大鼠眼内，于一定时间内分别用荧光显微镜观察GFP表达情况，用RT—PCR方法检测PEDF表达情况。结果（1）BN大鼠视网膜下注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP后1d即可见在荧光显微镜下观察到在注射点周围明显的绿色荧光蛋白分布于视网膜全层包括RPE细胞层，第2、3周荧光强度比第1周增强，荧光范围也有所扩大，可以持续表达4周。RT—PCR结果证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强。（2）经玻璃体腔注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP后第1天BN大鼠的视网膜和RPE细胞亦可见绿色荧光蛋白表达，且分布更均匀，范围更广。第1、2周表达明显增强，到第4周仍有表达。RT—PCR结果也证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强。结论阳离子脂质体可以成功介导PEDF—GFP基因转染至BN大鼠的视网膜组织、RPE细胞中，并能够持续表达。视网膜下注射和玻璃体腔注射均为有效的转染途径。本研究为视网膜，脉络膜新生血管性疾病的基因治疗奠定了基础。

白细胞介素-2与白细胞介素-23对小鼠类结合蛋白特异性T细胞向Thl、Thl7分化的诱导及致病性研究

目的探讨外源性白细胞介素（IL）-2和IL-23对小鼠类结合蛋白（IRBP）特异性T细胞向辅助性T细胞（Th）1、Thl7分化的诱导及致病性的研究。方法实验研究。向30只雌性C57BL／6小鼠（6-8周）皮下注射200IXl含200tag人IRBP1-20和0．8mg结核分枝杆菌的乳糜液，建立实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）动物模型。在免疫后第13天取出小鼠脾脏和引流淋巴结，预留部分脾脏通过逆转录（RT）-PCR法检测其中干扰素（IFN）-γ mRNA与IL-17mRNA的表达水平，作为正常对照组。其余脾脏在纱网研磨后用尼龙毛富集的方法提取小鼠T细胞，将其分为IL-2组和IL-23组，均加入抗原递呈细胞和IRBP1-20，分别加入外源性小鼠重组IL-2与IL-23。在培养后第2天用Ficoll密度梯度离心方法分离T细胞，RT-PCR法检测T细胞中IFN-γ mRNA与IL-17mRNA的表达情况，同时取T细胞上清液用酶联免疫吸附试验检测上清中IFN-γ与IL-17的含量。继续培养到第4天，利用流式细胞仪检测不同干预条件下IL-17＋ γδ＋T细胞的比例。取30只小鼠建立EAU模型后，取出T细胞，按照以上方法建立IL-2组和IL-23组IRBP特异性T细胞。另取6只小鼠随机分为两组，分别腹腔内注射IL-2组与IL-23组的T细胞，剂量为3．5×10^6个／只。在注射后第3、7、14天通过间接眼底镜观察小鼠的眼部发病情况，在第21天处死小鼠取出小鼠眼球做病理切片，观察IL-2组和IL-23组小鼠眼部病理变化。分别采用秩和检验、单因素方差分析和配对t检验对实验数据进行统计分析。结果在抗原和外源性IL刺激后第2天，T细胞出现明显的“玫瑰花环”现象。RT-PCR检测结果显示，IL-2组中IFN-1mRNA的表达水平（0．26±0．02）明显高于正常对照组（0．12±0．05）和IL-23组（0．10±0．00）（F=80．51，P=0．003）。IL-2组T细胞上清中IFN-γ的含量[（13124．67±107．73）μg/L]高于IL-23组[（3953．67±117．34）μg／L]（t=169．61，P=0．000），而IL-17的含量[（588．67±77．43）μg/L]低于IL-23组[（5038．33±88．00）μg／L]（t=-361．71，P=0．000）。流式细胞仪检测结果显示，IL-23组中分泌IL-17的78T细胞的比例为（9．93±0．55）％，高于IL-2组的（3．23±0．28）％（t=-33．18，P=0．001）。IL-2组和IL-23组小鼠在过继性转移免疫后第3天均未出现炎症反应，在第14天时两组小鼠炎症反应最重，IL-23组可见大量炎症细胞浸润、视网膜出血和视网膜脱离，明显重于IL-2组。结论IL-23对抗原特异性T细胞向Thl7细胞分化具有促进作用，其中Thl7细胞又以78T细胞为主，而IL-2对其却具有抑制作用。进一步的研究证实，IRBP特异性Thl7细胞的致病陡明显高于Thl细胞。

胎牛血清促进色素上皮衍生因子在皮肤角质形成细胞和成纤维细胞中的表达

目的:探讨表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响因素。方法:体外培养角质形成细胞和成纤维细胞,并以10%FBS(胎牛血清)刺激,通过免疫荧光和Western blot检测PEDF的表达。结果:PEDF大多位于细胞浆中,但在细胞核中也有少量表达。细胞浆中PEDF并非均质型分布,而是呈细颗粒状集聚。10%FBS促进角质形成细胞和成纤维细胞中PEDF的集聚和表达,而且这一分布形式不受组胺和佛波肉豆蔻醋酸(PMA)的影响。结论:10%FBS促进角质形成细胞和成纤维细胞中PEDF的集聚和表达。

色素上皮衍生因子对早期糖尿病大鼠视网膜谷氨酸和γ-氨基丁酸的影响

目的观察色素上皮衍生因子(PEDF)对糖尿病大鼠视网膜谷氨酸(Glu)及γ-氨基丁酸(GABA)的影响,探讨PEDF视网膜神经保护作用的机制。方法链脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射建立糖尿病模型,随机分为正常对照组、糖尿病组、糖尿病PEDF干预组和干预对照组。PEDF干预组于成模后第4周玻璃体腔注射重组大鼠PEDF 2μL,干预对照组予等量且pH值相等的磷酸盐缓冲液,注射后48h采用柱前衍生高效液相色谱法检测大鼠视网膜Glu和GABA的含量,并分析其相关性。结果糖尿病PEDF干预组视网膜中Glu和GABA含量及Glu/GABA较糖尿病组和干预对照组明显降低,组间差别有统计学意义(P<0.05),PEDF干预组视网膜中Glu和GABA的含量虽然高于正常对照组,但Glu/GABA与正常对照组间差别无统计学意义。结论 PEDF可以降低糖尿病早期视网膜中兴奋性氨基酸堆积,维持Glu/GABA的平衡,从而对视网膜神经组织起到一定的保护作用。

比较现代囊外摘出术与超声乳化吸出术对老年性白内障血-房水屏障功能的影响

目的比较老年性白内障现代囊外摘出术与晶状体乳化吸出术两种手术对眼血-房水屏障功能的影响。方法分别对32例(37眼)老年性白内障行经典的现代囊外摘出(10mm大切口)联合人工晶状体植入术以及60例(64眼)老年性白内障行超声乳化(3.2mm透明角膜切口)联合人工晶状体植入术,应用激光蛋白细胞检测仪定量检测手术前后房水蛋白浓度的变化。结果两组术前房水蛋白浓度差异无统计学意义(P>0.05),而术后各观察时期的房水蛋白浓度,差异均有统计学意义(P<0.05)。现代囊外摘出术组术后随访90d均高于术前,差异均有统计学意义(P<0.05);晶状体超声乳化组术后90d与术前比较,差异无统计意义(P>0.05)。结论比较白内障现代囊外摘出手术与晶状体超声乳化手术,前一种术式对血-房水屏障损伤较大,且血-房水屏障功能不能在短时间内修复。

青光眼滤过手术患者超声乳化白内障吸除术后血-房水屏障功能的改变

目的从血房水屏障功能方面评价青光眼滤过手术后白内障患者行超声乳化白内障吸除人工晶状体植入术的安全性。方法分别对40例(46只眼)青光眼滤过手术后白内障患者(试验组)和60例(64只眼)老年性白内障患者(对照组)行超声乳化白内障吸除人工晶状体植入术,使用激光蛋白细胞检测仪(LFCM)定量检测术前和术后1、7、30、90d房水蛋白浓度的变化,并进行比较。结果超声乳化白内障吸除人工晶状体植入术前及术后1、7、30、90d术眼平均房水闪光值试验组分别为(1512±287)、(4024±375)、(2433±338)、(2118±177)、(1651±170)光粒子数(PC)/ms,差异有统计学意义(P<005);对照组分别为(694±234)、(2627±1021)、(1396±644)、(907±267)、(716±189)PC/ms,差异有统计学意义(P<005)。其中2组术后1、7、30d均高于术前(P<005);术后90d与术前比较,差异均无统计学意义(P>005)。术前和术后1、7、30、90d2组平均房水闪光值比较,差异均有统计学意义(P<005)。试验组术后1d和30d与术前平均房水闪光值的差值均高于对照组(P<005)。结论青光眼滤过手术后患者血房水屏障功能紊乱;超声乳化白内障吸除人工晶状体植入术治疗青光眼滤过手术后白内障患者具有安全性,但加强抗炎性反应治疗,减轻手术损伤,是保证手术安全性的关键。

胎盘组织中色素上皮衍生因子蛋白的表达变化与子痫前期发病的关系

目的 探讨胎盘组织中色素上皮衍生因子（PEDF）蛋白表达及其与胎盘血管生成的机制在子痫前期发病中的作用.方法 选取2011年10月至2013年1月在南方医科大学南方医院妇产科住院分娩的子痫前期孕妇60例,分为子痫前期轻度组30例,子痫前期重度组30例；同期分娩的健康妊娠晚期孕妇40例作为对照组.采用蛋白印迹和免疫组化SP法测定各组孕妇胎盘组织中PEDF蛋白的表达,计数胎盘微血管密度（MVD）,对胎盘组织中PEDF蛋白表达与MVD进行相关性分析.结果 （1）胎盘病理：子痫前期轻度组和重度组胎盘重量明显减轻,绒毛血管数量减少,管腔狭窄,滋养细胞基底膜增厚；合体滋养细胞结节状增生,伴灶性梗死、纤维素样坏死或血栓形成.而对照组胎盘组织则无上述病理改变.（2） PEDF蛋白表达：子痫前期轻度组、子痫前期重度组和对照组胎盘PEDF蛋白表达水平分别为0.63 ±0.09、0.93±0.07和0.47 ±0.04,子痫前期轻度组及子痫前期重度组胎盘PEDF蛋白表达水平显著高于对照组,分别比较,差异有统计学意义（P＜0.05）；且子痫前期重度组显著高于子痫前期轻度组,两组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.（3）MVD检测：子痫前期轻度组、子痫前期重度组和对照组胎盘组织中MVD水平分别为106 ±9、93 ±8、136 ±9,子痫前期轻度组及重度组显著低于对照组,分别比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,且子痫前期重度组显著低于子痫前期轻度组,两组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.（4）相关性分析：子痫前期轻度组及子痫前期重度组胎盘组织中PEDF蛋白表达与MVD均呈负相关（分别为r=-0.426,P ＜0.05;r=-0.646,P＜0.05）,对照组胎盘组织中PEDF蛋白表达与MVD也呈负相关（r=-0.589,P＜0.05）.结论 子痫前期孕妇胎盘组织中PEDF蛋白高表达,导致胎盘血管生成障碍和胎盘发生缺血缺氧性病理改变,从而参与子痫前期的发病与病情进展.

广州开角型青光眼家系致病基因定位与功能初步研究

目的鉴定常染色体显性遗传家族性开角型青光眼家系(GZ.1)致病基因并探讨其致病机制。方法应用全基因组扫描、连锁分析、核苷酸直接测序法筛查GZ.1家系的致病性基因突变,进一步利用体外基因转染技术,观察突变型基因在小梁细胞中的表达、分布及对细胞凋亡的作用。结果GZ.1家系所有患者均存在myocilin基因第三外显子Pro370Leu杂合突变(16/16),而家系正常人中均未检测到该突变(0/8)。小梁细胞体外转染野生型和突变型myocilin基因后,经免疫印迹法检测证实,培养上清液中突变型myocilin蛋白的细胞外分泌较野生型明显减少;荧光免疫组化检测结果证实野生型myocilin蛋白在小梁细胞内呈点状、弥漫分布;而Pro370Leu突变型myocilin蛋白以积聚体形式存在于胞质内;经流式细胞仪检测突变型转染组凋亡细胞百分比较野生型转染组及对照组轻度升高。结论突变型(Pro370Leu)myocilin基因为GZ.1家系的致病基因,突变型(Pro370Leu)myocilin蛋白在小梁细胞内以积聚体形式存在,可能是由于蛋白质错误折叠所致,并可能诱导小梁细胞凋亡。

原发性开角型青光眼MYOC—TIGR基因突变研究

目的筛选并研究原发性开角型青光眼（POAG）小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白MYOC-TIGR基因突变情况。方法病例对照研究。抽取2002年1至12月就诊并诊断为POAG患者118例和150例非POAG对照者的外周静脉血4-8ml，采用酚-氯仿抽提全基因组DNA，应用聚合酶链反应（PCR）技术扩增全基因组DNA，以单核苷酸构象多态性（SSCP）分析MYOC基因的3个外显子（7对引物）编码区域序列改变。对SSCP分析异常者，采用双向测序法进一步证实。应用Cfrl3I、Hinfl及BsmAl等限制性内切酶检测对照者MYOC基因编码区序列改变。POAG与非POAG人群MYOC基因各位点突变率比较采用）（2检验。结果基因序列分析发现G12R、1288M及Y353I共3个基因序列改变。118例POAG患者中仅有5例（4．23％）发生G12R位点突变，150例对照者中未见G12R位点改变；两组G12R位点突变率比较差异有统计学意义（X^=4．37，P=0．037）。POAG组和对照组均有1288M和Y353I位点改变，但两组突变率比较差异无统计学意义（X^=0．07，P=0．791和）（2=0．56，P=0．453）。POAG患者基因突变率4．23％。结论MYOC基因突变可能与POAG发病有关，MYOC基因突变可能是POAG发病的分子机制之一（中华眼科杂志，2011，47：122-128）

原发性开角型青光眼家系的MYOC基因突变研究

目的对来自重庆地区的1个原发性开角型青光眼（POAG）家系进行MYOC基因突变筛查，研究POAG与MYOC基因突变的相关性，探讨MYOC基因突变在中国人POAG发病中的作用。方法1个4代共39例的青光眼家系，8例为已确诊患者，健康对照者100名。用单链构象多态性分析（SSCP）、PCR-限制性片段长度多态性（RFLP）和基因测序的方法筛选MYOC基因的突变（包括G34C、C136T、G144T、G227A、C624G、G736A、C1009G、A1036G、C1081T、G1099A、G1138A、A1139C、T1430A、C1441A和C1442T等），同时对检测到的突变结果进行生物信息学分析。结果在该家系中，发现1个G227A（Arg76Lys）突变，该突变存在2例已确诊的POAG患者和1例家系表型正常者中，健康对照者中未检出。发现1个缺失突变（C1009del），该突变存在于家系中所有发病患者和1例4岁的子代亲属，健康对照者中未检出。未发现其他突变。由于C1009del突变是首次发现，据此我们申请了GenBank号，已发表的GenBank序列号为FJ237047，对应的蛋白序列号为ACI62293。结论G227A（Arg76Lys）突变为已报道的多态性位点，与该家系青光眼的发病无相关性。移码突变C1009del突变与青光眼的发病密切相关，也可由此推测青光眼患者亲属的发病率较正常人高。

基因检测在一家族性青光眼家系中的预警作用

目的探讨基因检测技术对家族性青光眼家系新增成员的早期预警作用。方法前瞻性队列研究。对一家族性青光眼家系新增成员提取外周血DNA，进行myocilin基因突变筛查，根据基因检测结果将其分为myocilin基因突变携带组和非携带组，并对该家系成员进行前瞻性队列研究，观察其视力、眼压、视野、视乳头结构、视网膜神经纤维层改变情况。结果在12例家族新增成员中，DNA测序证实5例成员myocilin基因第3外显子呈现C→T杂合突变（Pro370Leu）；其余7例成员未显示myocilin基因突变。随访过程中，突变携带组成员均相继诊断为开角型青光眼，视野缺损距眼压升高平均时间为21．6个月，视网膜神经纤维层厚度发生变化距眼压升高平均时间为14．4个月；而非携带组成员在随访过程中眼压、视乳头结构、视网膜神经纤维层、视野均未出现病理性改变。结论myocilin基因为家族性青光眼的致病基因，基因诊断技术在青光眼家系中所表现的特异性及灵敏性可满足症状前诊断要求并具有预警作用。

Myocilin基因Gln368STOP位点突变与原发性开角型青光眼相关性的Meta分析

目的研究Myocilin（MYOC）基因Gln368STOP位点突变与原发性开角型青光眼（POAG）的相关性。方法以POAG患者和对照组基因型分布的优势比（OR）为统计量。电子检索和手工检索相关文献，剔除不符合要求的文献，应用RevMan 4．2软件对各纳入研究结果进行异质性检验，采用相应数学模型进行数据合并，并评价发表偏倚的影响。结果共检索到符合要求的文献11篇，均为病例-对照研究，POAG患者共3077例，对照组共2063例，数据合并结果显示POAG组与对照组发生Gln368STOP位点突变的OR值（95％C1）为6．01（2．57～14．04，P〈0．01）。结论MYOC基因Gln368STOP位点突变与POAG患病风险增加相关，是POAG发病的危险因素之一。

高功率微波对家兔视网膜睫状神经营养因子蛋白表达的影响

目的探讨高功率微波（HPM）急性辐照后,家兔视网膜组织睫状神经营养因子（CNTF）的蛋白表达量在不同时间的变化以及CNTF的分布,寻找HPM急性辐照后CNTF蛋白的变化规律。方法采用免疫组化以及半定量检测的方法检测90 W／cm^2、15 min辐照后0、3、6、12、24、72 h各个不同时相点家兔视网膜组织CNTF的蛋白表达变化及分布。结果CNTF在视网膜全层均有表达,主要分布于视网膜组织的细胞膜和胞浆中,而胞核染色不明显。CNTF蛋白表达在HPM辐照后有不同程度的变化,辐照后即刻下降约14％,而在6 h表达上调22％,并达到峰值水平,随后维持在对照水平。结论HPM急性辐照能即刻影响家兔视网膜CNTF蛋白的表达,其表达量与损伤时间之间存在时效关系。HPM辐照引起的CNTF表达变化可能参与了微波辐照所致的家兔视网膜组织损伤,为利用外源型CNTF治疗微波辐照所致的家兔视网膜组织损伤提供理论依据。

蓝光致人RPE细胞分泌VEGF及PEDF变化及与Ca2＋-PKC信号通路的关系

目的 探讨蓝光照射致体外培养人RPE细胞分泌VEGF、色素上皮衍生因子（PEDF）、RPE细胞内三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）的浓度变化,分析Ca2＋-蛋白激酶C（PKC）信号通路之间的相互作用.方法 实验研究.将体外培养的第4代人RPE细胞随机分为6个组,A组：无光照组;B组：蓝光光照组;C组：蓝光光照＋PKC激动剂佛波酯（PMA）组;D组：蓝光光照＋PKC抑制剂钙磷酸结合蛋白（Calphostin C）组;E组：蓝光光照＋硝苯地平组;F组：蓝光光照＋钙磷酸结合蛋白组＋硝苯地平组.用（2 000±500）lux蓝光照射体外培养人RPE细胞6h,终止培养24 h,采用ELISA测定各组RPE细胞分泌VEGF、PEDF、RPE细胞内IP3和DAG的浓度,采用流式细胞仪检测A、B及F组细胞的凋亡率.结果 A～E组的VEGF浓度分别为（584.38± 10.66）、（700.70±5.88）、（698.21±6.66）、（623.87±3.12）、（648.30±4.91） ng/L.其中B、C、E组的VEGF浓度高于A组,差异有统计学意义（P=O.002,0.002,0.016）.A～E组的PEDF浓度分别为（75.96±1.70）、（71.82±1.67）、（72.43±0.58）、（86.31＋1.35）、（93.716±1.24） μg/L.其中B、C组PEDF浓度低于A组（P=0.004,0.011）.B组和C组的VEGF/PEDF比值显著高于A组（P=0.008,0.027）,E组和D组的VEGF/PEDF比值低于B组（P=0.016,0.015）.A～E组的IP3浓度分别为（9 108.42±0.74）、（117.23±1.05）、（137.12±2.70）、（139.17±1.39）、（149.60±0.76） μg/L.B、C、D、E组IP3浓度均高于A组（P=0.003,0.007,0.000,0.000）,并且C、D、E组IP3浓度均高于B组（P=0.011,0.000,0.000）.A～E组的DAG浓度分别为（995.47±13.61）、（1070.10±10.07）、（1046.39±7.90）、（1041.12±9.76）、（1273.13±10.89） pmol/L.B、C、D、E组DAG浓度均高于A组（P=0.000,0.000,0.000,0.000）,与B组比较,组DAG的浓度增高（P=0.000）,而C、D组DAG浓度降低（P=0.021,0.007）.A、B和F组的细胞凋亡率分别是（10.26±1.87）％、（25.06±2.66）％和（19.36±3.23）％.与A组比较,B组和F组的细胞凋亡率升高（P=0.001,0.009）;与B组相比较,F组的细胞凋亡率下降（P=0.038）.结论 蓝光照射可致人RPE细胞分泌VEGF量增加,PEDF量减少;VEGF与PEDF的比值升高;IP3和DAG浓度增加.L型钙通道及Ca2＋-PKC信号通路参与调节蓝光照射导致体外培养的人RPE细胞VEGF、PEDF、IP3和DAG浓度变化,可能存在反馈调节机制.钙磷酸结合蛋白与硝苯地平联合应用可抑制蓝光照射导致体外培养的人RPE细胞凋亡.

Best卵黄样黄斑营养不良一家系的临床表型特征和基因研究

目的探讨Best卵黄样黄斑营养不良（BVMD）一家系的临床表型特征和相关基因VMD2的突变特点。方法回顾性分析BVMD一家系患者详细的临床资料，包括眼底检查、荧光素眼底血管造影（FFA）及相干光断层扫描（OCT）图像等，并对患眼病变进行分期。同时对该家系5例患者及其家族中2名正常成员进行基因分析。采取外周血2．7ml，制备外周血白细胞基因组DNA，应用合成的特异性引物，以聚合酶链反应（PCR）分别扩增VMD2基因的第1—11对外显子，将基因产物进行直接测序，分析相应基因序列。结果该家系呈现常染色体显性遗传。5例（10只眼）眼底病变分别属于0、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲ和Ⅳ期，较为少见。各期的眼底改变、FFA和OCT图像特征虽不相同，但具有代表性。基因序列分析可见VMD2基因第301密码子第3个碱基呈杂合子点突变，即T—G，导致天冬氨酸变为谷氨酸（Asp301Glu）。结论我国BVMD一家系呈现VMD2基因突变。基因分析结果将为疾病的确诊提供可靠依据。

我国诺里病家系NDP基因的突变分析

目的对我国诺里病一家系进行致病基因突变的鉴定，确定其家系中是否存在ⅣDP基因突变。方法基因家系研究。发现一个3代均患有诺里病的家系，共13人，患者3人，现存患者仅先证者1人，为20月龄男孩。根据诺里病家族史、临床体征及眼科B超检查对患者进行临床诊断；采集该家系成员外周血标本，常规提取基因组DNA；设计并合成3对特异性引物，通过PCR扩增NDP基因的外显子及外显子与内含子交界区，PCR产物直接测序；通过PCR产物限制性内切酶分析和基因型分析对家系所有13名成员进行突变鉴定。结果基因测序结果显示先证者及其母亲均具有NDP基因突变C．220C〉T（P．Arg74Cys），且先证者为该突变的半合子，其母为该突变的携带者；NDP基因突变鉴定表明家系中另外4个表型正常的个体（Ⅲ3、Ⅳ4、Ⅲ5和Ⅱ2）均为该突变的携带者。结论我国诺里病一家系中发现存在NDP错义突变C．220C〉T。

子宫内膜癌组织中DACH1基因启动子的甲基化状态及其临床意义

目的探讨子宫内膜癌组织中DACH1基因启动子的甲基化状态及其临床意义。方法选取2004年2月至2008年8月间山东大学齐鲁医院及第二医院行全面分期手术并经病理检查确诊的80份子宫内膜癌组织，以同期（2008年）因功能失调性子宫出血行诊刮并经病理检查确诊为正常子宫内膜的20份组织标本作为对照。采用甲基化特异性PCR（MSP）技术检测子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织中DACH1基因启动子的甲基化状态，蛋白印迹法检测其DACH1蛋白的表达，并分析DACH1基因启动子的甲基化状态与子宫内膜癌临床病理特征的关系。结果MSP技术检测显示，子宫内膜癌组织中DACH1基因启动子的甲基化阳性率为30％（24／80），明显高于正常子宫内膜组织（5％，1／20），差异有统计学意义（P〈0．05）。DACH1基因启动子甲基化阳性的子宫内膜癌组织中DACH1蛋白为阴性或弱阳性，而DACH1基因启动子甲基化阴性的子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中DACH1蛋白表达阳性；在24份DACH1基因启动子甲基化阳性的子宫内膜癌组织中，DACH1蛋白表达强度与DACH1基因启动子的甲基化程度呈明显负相关关系（r=-0．30，P=0．008）。子宫内膜癌组织中，病理分级为G1-G2的癌组织中DACH1基因启动子的甲基化阳性率为18％（7／39），显著低于G，者（41％，17／41），差异有统计学意义（P〈0．05）；病理类型为子宫内膜样腺癌的癌组织中DACH1基因启动子的甲基化阳性率为23％（12／53），显著低于特殊类型子宫内膜癌（包括子宫内膜浆液性乳头状癌和子宫内膜透明细胞癌）的44％（12／27），差异有统计学意义（P〈0．05）；而DACH1基因启动子的甲基化状态与患者的年龄、手术病理分期、肌层浸润深度及淋巴结转移无关（P〉0．05）。结论子宫内膜癌组织中DACH1基因启动子的甲基化导致DACH1蛋白表达降低或缺失，这可能是导致DACH1基因在子宫内膜癌中失活的分子生物学机制之一。

高氧诱导小鼠视网膜病变模型中血管内皮生长因子和色素上皮衍生因子的表达及意义

目的研究高氧诱导小鼠视网膜病变模型中血管内皮生长因子（VEGF）和色素上皮衍生因子（PEDF）的表达和意义，并探讨两者在视网膜新生血管形成过程中的作用。方法对照实验研究。对新生C57BL-6N系小鼠给予高氧后，置相对低氧环境中饲养，诱导产生视网膜新生血管。在小鼠生后第12、14及17天摘除眼球，通过逆转录聚合酶链反应和免疫印迹法及荧光素灌注造影，分别检测不同时间点全视网膜新生血管组织对VEGF与PEDF的mRNA和蛋白质的表达水平的差异，并观察视网膜新生血管的分布与形态变化，通过血管内皮细胞计数对新生血管进行量化。应用SPSS11．5统计学软件，采用析因设计方差分析，分别比较实验组与对照组mRNA与蛋白质表达水平的差异，以P〈0．05作为差异有统计学意义。结果在高氧环境中（出生第12天小鼠），OIR模型鼠VEGF蛋白质表达A值（0．47±0．12）较正常鼠（1．81±050）下降，PEDF蛋白质表达A值（5．35±0．94）较正常鼠（0．68±0．17）明显升高；而相对低氧环境中（出生第14和17天小鼠），VEGF蛋白质表达A值（2．15±0．46，5．49±0．97）较正常鼠（0．90±0．05，0．88±0．91）明显升高，PEDF蛋白质表达A值（2．07±0．35，1．37±0．48）较正常鼠（2．62±0．68，5．30±0．59）明显下降，尤以第17天下降显著。对不同时间点VEGF和PEDF蛋白质表达水平进行析因方差分析，结果显示各时间点的VEGF蛋白质表达水平差异有统计学意义（F=70．450，P=0．000），各时间点的PEDF蛋白质表达水平差异有统计学意义（F=160．237，P=0．000）。出生第12、14及17天小鼠视网膜VEGF蛋白质的表达与正常对照组比较，差异有统计学意义（P=0．009，0．010，0．000），PEDF蛋白质的表达差异也有统计学意义（P=0．002，0．046，0．000）；出生第12、14及17天小鼠视网膜VEGF mRNA的表达与正常对照组比较，差异有统计学意义（P=0．001，0．000，0．001），PEDF mRNA的表达差异也有统计学意义（P=0．000，0．001，0．000）。伴随着视网膜组织的缺氧，出现了VEGF蛋白质表达水平升高和PEDF蛋白质表达水平降低，导致视网膜组织中VEGF与PEDF蛋白质表达失衡；VEGF与PEDF的mRNA表达亦发生类似变化，且较蛋白质改变提前发生。上述改变均伴随着同期视网膜新生血管的发生、发展及其严重程度而逐渐加重。结论VEGF和PEDF的mRNA和蛋白质表达失衡可能是造成视网膜新生血管发生的机制之一。

重组AAV2-色素上皮衍生因子对人视网膜微血管内皮细胞增殖的影响

目的 体外培养人视网膜微血管内皮细胞,探讨重组rAAV2-色素上皮衍生因子（PEDF）对该细胞在不同氧环境下增殖的影响.方法 实验研究.2%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶消化视网膜,获得视网膜微血管内皮细胞;接种于预先包被纤维连接蛋白的培养瓶内,用含10%胎牛血清、内皮细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒添加物的内皮细胞培养基,置于5%CO237 ℃培养箱内培养.相差显微镜观察细胞形态及生长情况.抗第Ⅷ因子相关抗原抗体鉴定内皮细胞.以125 μmol/L CoCl2建立HRCECs化学低氧模型,观察低氧对内皮细胞增殖的影响.按照105病毒基因组数/细胞的剂量进行rAAV2-PEDF病毒转染,分别设空白和阴性对照,激光共焦显微镜下观察EGFP阳性细胞,免疫印迹法检测PEDF蛋白表达.MTT法测定rAAV2-PEDF对不同氧条件下对细胞增殖的影响.流式细胞仪检测rAAV2-PEDF对不同氧条件下对细胞凋亡的影响.两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用方差分析.结果 原代培养的人视网膜微血管内皮细胞48～72 h贴壁,2周左右细胞融合.第Ⅷ因子相关抗原鉴定细胞呈阳性.转染病毒48 h后,激光共焦显微镜下观察可见EGFP阳性细胞,免疫印迹法检测,实验组PEDF表达明显强于其他组.MTT结果显示,单纯低氧处理,正常对照组A值为0.085±0.021,实验组A值为0.166±0.024（t=3.938,P＜0.05）.rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,A值分别为：正常对照组0.171±0.011,rAAV2-EGFP组0.178±0.016,rAAV2-PEDF组0.169±0.017（F=0.01,P＞0.05）.rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,A值分别为：单纯CoCl2组0.166±0.013,CoCl2＋rAAV2-EGFP组0.155±0.012,CoCl2＋rAAV2-PEDF组0.116±0.015（F=6.25,3.50;P＜0.05）.rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,正常对照组凋亡细胞比例为2.3%,rAAV2-EGFP组为3.3%,rAAV2-PEDF组为1.7%.rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,单纯CoCl2组凋亡细胞比例为3.6%,CoCl2＋rAAV2-EGFP组为6.7%,CoCl2＋rAAV2-PEDF组为36.4%.结论 rAAV2-PEDF转染人视网膜微血管内皮细胞后PEDF可稳定表达,并能显著抑制低氧诱导下内皮细胞的增殖.