中华眼镜蛇毒口服血清制剂对HepG2细胞凋亡的影响

目的 :观察中华眼镜蛇毒口服血清制剂对人肝癌细胞凋亡的影响。方法 :HE染色、TUNEL、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术、免疫组化。结果 :中华眼镜蛇毒口服血清制剂以剂量依赖方式显著诱导HepG2细胞的凋亡。可见 :细胞核浓缩 ,细胞体积缩小 ;TUNEL阳性细胞明显增多 ;DNA呈现典型“梯形”变化 ;c -jun ,c-myc基因表达明显升高。结论 :中华眼镜蛇毒口服血清制剂诱导人肝癌细胞的凋亡 ,可能与c -jun ,c-myc基因的表达上调有关。

分离纯化眼镜蛇蛇毒因子的一种经济方法

将较大批量的眼镜蛇粗毒依次通过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５，ＤＥＡＥ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅＤＥ５２和Ｂｉｏ－ＧｅｌＰ２００柱层析可高效地分离纯化眼镜蛇蛇毒因子（ＣＶＦ），５０ｇ粗毒可制备电泳纯ＣＶＦ９６０ｍｇ，产率大大高于既往文献报道，整个制备过程仅需时数日。通过ＳＤＳ聚内烯酰胺凝胶电泳测得其分子量为２２６０００，其溶血活性从抗补体活性均与文献报道相近。所以，本实为一种经济，高效的实验室大量制备ＣＶＦ的方法。

中华眼镜蛇毒对荷人鼻咽癌裸鼠血过氧化氢酶和GSH-PX活性的影响

目的 :探讨中华眼镜蛇毒 (NNAV)对荷人鼻咽癌 (NPC)裸鼠血中过氧化氢酶 (CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH -PX)活性的影响。方法 :采用比色法检测经腹腔注射低、中或高浓度NNAV( 1mg/L、5mg/L或 10mg/L)的荷人NPC裸鼠血中CAT和GSH -PX活性。结果 :荷人NPC裸鼠组血中CAT活性 ( 1645 0U/L)低于正常裸鼠组( 2 0 680U/L) (P <0 0 5 ) ,而荷瘤裸鼠组血中GSH -PX活性 ( 2 7670U/L)与正常裸鼠组 ( 2 8790U/L)相比P >0 0 5。低、中和高浓度NNAV治疗后的荷瘤鼠组血中CAT活性 ( 2 0 5 70U/L、2 3 0 90U/L、2 12 80U/L)均高于荷瘤鼠组( 1645 0U/L) (P <0 0 5 ) ,并接近正常水平 ( 2 0 680U/L) (P >0 0 5 )。同时低、中和高浓度用药组血中GSH -PX活性均不同程度地高于荷瘤鼠组 ( 2 7670U/L) (P <0 0 5 ) ,其中高浓度组 ( 3 7810U/L)明显高于低或中浓度组 ( 2 994 0U/L、3 0 610U/L) (P <0 0 5 ) ,其血中GSH -PX活性明显高于正常裸鼠组 ( 2 8790U/L) (P <0 0 5 )。结论 :NNAV的抑瘤作用可能与其提高荷瘤鼠血中CAT和GSH -PX活性有关。

徐长卿提取液对眼镜蛇蛇毒引起的炎症及毒性的影响

目的 探讨徐长卿提取液对眼镜蛇毒的解毒作用。 方法 (1)采用眼镜蛇蛇毒对大鼠足跖肿胀的致炎模型 ,观察徐长卿提取液灌胃给药后 ,对大鼠足跖肿胀度的影响 ;(2 )观察徐长卿提取液对大鼠腹股沟植入含眼镜蛇毒棉球形成的肉芽肿的影响 ;(3)观察徐长卿提取液灌胃对眼镜蛇毒中毒小鼠的解毒作用。 结果 以 5 ,10 ,15 g/kg徐长卿提取液灌胃对眼镜蛇毒引起的大鼠足跖肿胀及棉球肉芽肿均有显著的抑制作用。眼镜蛇毒所致的大鼠足跖肿胀的抑制率用药后 1h分别是 2 5 .1% ,2 9.7% ,36 .6 % ,用药后 3h分别是 2 8.9% ,37.3% ,4 0 .7% ;徐长卿提取液灌胃(1/d× 7)对腹股沟棉球肉芽肿的抑制率分别为 2 8.9% ,39.8% ,2 9.6 % ;徐长卿提取液灌胃对眼镜蛇毒中毒小鼠有明显的减毒作用 (P<0 .0 5 )。 结论 徐长卿对眼镜蛇毒引起的炎症及毒性有明显的对抗作用。

眼镜蛇毒溶解因子对人鼻咽癌细胞株的毒性及其与抗癌药的协同作用

目的 :探讨纯化的眼镜蛇毒因子 (CVF) ,CVF和单抗交联物 (BAC5 -CVF)和直接溶解因子 (DLF)对人鼻咽癌细胞株的毒性及DLF和抗癌药的相互作用。方法 :用MTT法或台盼蓝拒染法了解合并用药的细胞毒作用。结果 :CVF本身对CNE2细胞并无细胞毒性 ;BAC5 -CVF对CNE2细胞有剂量依赖性杀伤作用 ,其IC5 0为 3 0 7× 10 -7mol/L ;引起 2 2 0 3 %抑制效应的DLE与长春碱 (VLB)、甲氨蝶呤 (MTX)、阿霉素 (ADM)、氟尿嘧啶 ( 5 -FU)和平阳霉素 (BLM)有协同作用 ,但能拮抗氮芥 (HN2 )作用。结论 :CVF不引起CNE2细胞毒性 ,但BAC5 -CVF和DLE对CNE2细胞有毒性作用 ;除能拮抗氮芥外 。

福建产舟山眼镜蛇毒细胞毒素的快速分离纯化及鉴定

目的 从舟山眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素 (CTX) ,并鉴定其理化性质。 方法 采用 SP- SephadexC- 2 5阳离子交换色谱及 Sephasil Peptide C1 8反相高效液相色谱法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化 CTX,SDS- PAGE(Tris- Tricine系统 )鉴定纯度 ,Edman降解法测定 N端氨基酸序列。 结果 粗毒经阳离子交换色谱 ,得到 1 4个蛋白峰 ,其中第 ～ 峰具 CTX活性 ;再分别经反相色谱纯化 ,得到 4个 CTX,总得率为 32 .4 8% ;SDS- PAGE显示为均一蛋白 ,分子量依次为 :7.2 8,7.33,7.2 4和 7.38k D;测定它们 N端 2 0个氨基酸序列。 结论 采用阳离子交换和反相高效液相色谱可快速、高效地从眼镜蛇毒中获得 4个

眼镜蛇毒抗补体因子的研究

Cobra venom factor (CVF), separated from the cobra venoms, is an acidic glucoproteins with anticomplementory activity The combination of CVF with factor B in the blood produces a stable C3 and C5 converterase resulting in complement depletion by activating complement continually. There are many studies on it, such as inflammation, autoimmune disease, xenotransplantation, anti-tumor, etc. CVF is also an important tool drug for the study of complement role in the pathophysiological development of diseases.

中华眼镜蛇毒组份Ⅲ的药代动力学及组织分布研究

目的 :观察中华眼镜蛇 (Najanajaatra)蛇毒组份Ⅲ在兔体内的药代动力学过程和在小鼠体内的分布状况。方法 :用氯胺 -T法对眼镜蛇毒组份Ⅲ进行碘化标记 ,用放射性核素示踪动力法检测血液中的药物浓度 ,以放射性参与量 (脏器与血液放射比 )的比值作为组份Ⅲ在组织中分布的依据。结果 :兔静脉注射眼镜蛇毒组份Ⅲ 75、15 0和 30 0 μg/kg 3个剂量后 ,快分布相半衰期T1/2 α为 39 6 - 4 2 5min ,慢分布相半衰期T1/2 β为 16 8- 17 3h ,消除相半衰期T1/2 γ为 2 1 7- 2 2 1h。小鼠尾静脉注射 [12 5Ⅰ ]-组份Ⅲ后 ,2h及 4h放射性参与量大于 1的器官为肝脏、肾脏、肺脏、心脏和肌肉 ,其中以肾脏分布最高 ,且 4h放射性参与量高于 2h。结论 :兔静脉注射组份Ⅲ 3个剂量后 ,血药 -时间曲线经 3P87药动学程序拟合符合三房室模型特征 ,3个时相的半衰期各剂量组之间无显著差异 ,曲线下面积 (AUC)与剂量成正比 ,表明药物在兔体内的分布和消除为一级线性动力学过程。小鼠静注组份Ⅲ后 2h ,以肾脏分布最高 ,肝脏与肺脏的放射性参与量也较高 。

中国眼镜蛇毒蛋白酶(natrahagin)的抗凝作用

目的观察具有纤维蛋白原水解活性的中国眼镜蛇毒蛋白酶（ｎａｔｒａｈａｇｉｎ）在动物体内的抗凝作用。方法将不同浓 度的ｎａｔｒａｈａｇｉｎ分别静脉注射入大鼠体内，观察其在动物体内的抗凝作用并与生理盐水对照。凝血仪上直接测定血浆 凝血酶原时间（ＰＴ）、凝血酶时间（ＴＴ）和活化部分凝血活酶时间（ＡＰＴＴ），双缩脲法测定血浆纤维蛋白原水平。结果与对照 组比较，不同剂量ｎａｔｒａｈａｇｉｎ静脉注射给药后，大鼠ＰＴ、ＴＴ和ＡＰＴＴ显著延长，效应呈浓度依赖性。剂量为０．１ｍｇ．ｋｇ·ｂｗ． 时，ＰＴ、ＴＴ和ＡＰＴＴ分别为对照组的１．５、１．５和１．９倍；兔血浆纤维蛋白原水平也显著降低，血浆纤维蛋白原水平降至 对照组的３３．３％。结论Ｎａｔｒａｈａｇｉｎ在体内具有抗凝活性。

舟山眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶的分离纯化、理化及酶学性质

目的从舟山眼镜蛇蛇毒中分离L-氨基酸氧化酶(LAO),测定其理化和酶学性质。方法应用Sephadex G-100凝胶色谱和POROS CM20离子交换色谱分离纯化LAO;Wellner和Lichtenberg法测定LAO活力;SDS-PAGE法测定相对分子质量。结果舟山眼镜蛇蛇毒经Sephadex G-100凝胶色谱和两次POROS 20离子交换色谱后,获得LAO纯品(暂定名NA-LAO)。NA-LAO在非还原和还原条件下相对分子质量均为58 kD左右;其反应最适pH为8.0,最适温度为60℃,对L-苯丙氨酸的米氏常数(Km)为3.08 mmoL/L。结论应用凝胶过滤色谱和离子交换色谱可从舟山眼镜蛇毒中分离纯化LAO。

舟山眼镜蛇毒细胞毒素-Ⅻ的抗肿瘤作用

目的 了解舟山眼镜蛇毒细胞毒素 - (CTX- )的抗肿瘤作用。 方法 应用磺胺邻二甲氧嘧啶(SRB)法观察不同浓度 CTX- 对人肝癌 Bel74 0 4细胞和人早幼粒白血病 HL - 6 0细胞的生长抑制作用。观察CTX- 0 .4 ,0 .2 ,0 .1mg/ kg腹腔注射对 U 14荷瘤小鼠瘤块质量的影响并计算抑瘤率 ;CTX- 0 .4和 0 .2 m g/kg静脉注射对艾氏腹水癌 (EAC)小鼠腹水形成的影响并计算腹水减少率。 结果 CTX- 可明显抑制人肝癌Bel74 0 4细胞和人早幼粒白血病 HL - 6 0细胞的生长 ,其 IC50 分别为 (1.12± 0 .13)和 (1.6 1± 0 .18)μg/ m L。 CTX- 0 .4 ,0 .2和 0 .1m g/ kg腹腔注射× 10 d,对宫颈癌 U14抑瘤率分别为 30 .5 0 % (P<0 .0 1) ,19.0 2 % (P<0 .0 5 )和12 .0 8% (P>0 .0 5 ) ;CTX- 0 .4和 0 .2 mg/ kg静脉注射× 3d对 EAC小鼠腹水形成减少率分别为 2 5 .5 % (P<0 .0 5 )和 14 .5 % (P>0 .0 5 )。 结论 舟山眼镜蛇毒细胞毒素 - 具有明显的抗肿瘤作用。

中华眼镜蛇毒因子清除补体建立异种心脏移植急性血管性排斥反应模型

目的 采用纯化中华眼镜蛇毒因子 (CVF)清除补体 ,建立豚鼠 -大鼠非协调性异种心脏急性血管性排斥反应 (AVR)模型。 方法 供者豚鼠和受者 SD大鼠各 38只 ,分为 3组 : 组 (超急排组 ,n=2 0 ) ,受者不进行任何预处理 ; 组 (小剂量 CVF组 ,n=1 0 ) ,受者移植前 1 d经腹腔注射 CVF2 0 0 μg/ kg,移植后每日注射 1 0 0 μg/kg直至供心停搏 ; 组 (大剂量 CVF组 ,n=8) ,受者移植前 1 d经腹腔注射 CVF4 0 0 μg/ kg,移植后每日注射 2 0 0μg/ kg直至供心停搏。观察供心存活时间 ,供心停跳后行病理组织学检查。 结果 组和 组供心平均存活时间分别为 (4 1± 2 ) h和 (4 0± 3) h明显长于 组 [(1 7± 2 ) min,P<0 .0 1 ], 组与 组间差异无显著性 (P>0 .0 5 )。病理检查 : 组呈超急性排斥反应 (HAR)改变 ,而 、 组呈 AVR改变 ; 、 组移植物炎症细胞浸润数明显多于 组(P<0 .0 1 ) ,移植物补体 C3沉积明显少于 组 (P<0 .0 1 )。 结论 适当剂量纯化 CVF具有良好的清除大鼠补体C3作用 ,克服豚鼠—大鼠非协调性异种心脏移植物 HAR的发生 ,延长其存活时间 ,建立以炎症细胞浸润为主的异种移植

中华眼镜蛇毒F组份对血小板活化时蛋白酪氨酸磷酸化的影响

目的 :观察中华眼镜蛇毒F组份抑制血小板聚集的胞内信号转导机制。方法 :实验分 6组 :(1)空白组 ;(2 )对照组 ;(3) - (6 )实验组加入浓度为 10 0、30、10、3mg/LF组份。用比浊法测定血小板聚集率。用蛋白质免疫印迹法 (Westernblotting)测定血小板内蛋白酪氨酸磷酸化的表达。结果 :F组份呈浓度依赖性抑制二磷酸腺苷 (ADP)引起的分子量为 76、6 6和 37 5kD蛋白酪氨酸磷酸化的表达 ,其中 30、10 0mg/L给药组中 ,3个分子量蛋白与对照组比较均有显著差异 ,P <0 . 0 5。F组份对ADP引起血小板聚集作用的抑制同降低 76、6 6和 37 5kD 3个分子量蛋白酪氨酸磷酸化的表达呈明显的正相关 (r=0 . 936 7,P <0 . 0 1)。结论 :中华眼镜蛇毒F组份通过抑制分子量为 76、6 6和37 5kD蛋白的酪氨酸磷酸化表达 ,对血小板胞内信号转导过程发生影响 ,可能是其抗栓机制之一。

眼镜蛇毒因子对大鼠油酸型肺损伤的保护作用

采用大鼠油酸型呼吸窘迫综合征的病理模型（ｉｖ油酸０．１ｍＬｋｇ－１）．实验前２４ｈｉｐ眼镜蛇毒因子（ＣＶＦ）１．０ｍｇｋｇ－１耗竭体内补体，能显著对抗油酸引起的肺损伤：使支气管肺泡灌洗液中的细胞计数从（１５±１１）×１０１０Ｌ－１下降至（６±４）×１０１０Ｌ－１，蛋白质含量从５．２±１．９ｇＬ－１降至２．４±１．３ｇＬ－１；减少氧自由基的产生，血清超氧化物歧化酶活性下降和丙二醛含量升高明显受到抑制；降低溶酶体酶的释放，表现为血清β－葡萄糖醛酸酶活性降低；肺病理形态学的改变减轻，其中肺水肿程度，透明膜和肺动脉血栓形成均明显减轻．结果表明补体可能在油酸性肺损伤中起着重要作用，ＣＶＦ耗竭补体能显著减轻肺损伤．

舟山眼镜蛇毒细胞毒素-F对人鼻咽癌细胞和乳鼠心肌细胞的抑制作用

目的 观察舟山眼镜蛇毒细胞毒素 - F(CTX- F)对人鼻咽癌细胞 (CNE)和乳鼠心肌细胞的抑制作用 ,了解 CTX- F对人癌细胞株的选择性抑制作用 ,并初步探讨其作用机制。 方法 以磺胺邻二甲氧嘧啶法观察CTX- F0 .6 2 5 ,1 .2 5 ,2 .5 ,5和 1 0 μg/ m L 对体外培养 CNE和乳鼠心肌细胞的杀伤作用及作用的量效关系 ,同时观察 CTX- F作用 0 .5 ,1 ,2 ,4和 8h的时效关系 ,并比较 CTX- F对上述两种细胞作用的差异 ;采用透射电镜观察CTX- F对 CNE细胞形态的影响。 结果 CTX- F在 0 .6 2 5 μg/ m L 作用 0 .5 h时即可抑制 CNE细胞的生长 ,生长抑制率约为 7% ,1 0 μg/ m L 作用 0 .5 h,生长抑制率即可达 70 .3% ,作用存在明显的剂量依赖性 ,其 IC50 (μg/ m L)为1 .5 2。CTX- F作用 0 .5 h对 CNE细胞的 IC50 为 3.83,8h为 1 .5 3,有明显的时效关系。CTX- F乳鼠心肌细胞也有破坏作用 ,但敏感性较低 ,IC50 为 5 .92 ,约为 CNE细胞的 4倍。CNE细胞经 CTX- F(0 .6 2 5 μg/ m L)作用 0 .5 h后 ,电镜下可见到细胞核内染色质边集或固缩成团聚集在细胞的一侧 ,时间延长 ,可见细胞死亡。 结论 舟山眼镜蛇毒CTX- F对 CNE细胞有剂量和时间依赖性杀伤作用 ,其敏感性高于乳鼠心肌细胞。

舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽的分离及其对M胆碱受体的激动效应

目的从舟山眼镜蛇Naja atra蛇毒中分离毒蕈碱样多肽,探讨其与M胆碱受体的关系。方法应用分子筛凝胶Sephadex G-50、Sephadex G-100、离子交换凝胶CM-Sepharose F.F.分离纯化目的组分;SDS-PAGE鉴定目的蛋白的纯度并测定其相对分子质量;放射受体分析法测定该物质与大鼠脑组织M胆碱受体的亲和力;选用离体豚鼠回肠纵行肌观察其对M胆碱受体的效应。结果从舟山眼镜蛇蛇毒中获得一种与大鼠脑组织M胆碱受体具有高亲和力的多肽(Ki为10.12 nmol/L),其相对分子质量约14 kD。该多肽可引起离体豚鼠回肠纵行肌收缩,此效应可被阿托品阻断。结论舟山眼镜蛇蛇毒中获得与M胆碱受体具有高亲和力的多肽,该多肽对M胆碱受体具有激动效应。

眼镜蛇长链神经毒素镇痛效应及可能机制

目的探究眼镜蛇长链神经毒素(CBT)的镇痛作用及可能机制。方法采用在体细胞外记录方法记录慢性炎症痛模型大鼠脊髓背角神经元的痛诱发放电,分别对六组实验大鼠注射生理盐水(5μL)、CBT(20、40、80 ng/kg)、阿托品(2 mg/kg)、阿托品(2 mg/kg)+CBT(40 ng/kg),观察不同含量CBT对脊髓背角神经元痛诱发放电的影响,同时观察胆碱能受体拮抗剂阿托品能否翻转其镇痛效应。结果不同含量CBT均可以显著抑制慢性炎症痛大鼠脊髓背角神经元的痛诱发放电,各含量CBT组放电频率与生理盐水组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),且该效应可被阿托品所阻断,阿托品+CBT组在20、30、40、50、60 min放电频率与CBT(40 ng/kg)组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论CBT具有显著的镇痛效应,该效应有一定的剂量依赖性,胆碱能受体系统参与了其镇痛过程。

中华眼镜蛇毒组分对神经胶质瘤细胞U251生长的抑制作用

目的：探讨中华眼镜蛇毒卡迪（KD）中进一步分离纯化的10个组分KDⅠ-1、KDⅠ-1H、KDⅠ-2、KDQⅠ-2、KDⅡ、KDⅡ-2、KDⅡ-3，KDⅢ-1，KDⅢ-2和KDⅢ-2对神经胶质瘤细胞U251的抑制作用。方法：采用MTT法和台盼蓝拒染法观察各组分对U251细胞增殖的影响。结果：在1～100μg/ml．的浓度范围内用MTT法筛选出3个具有显著抑制作用的组分KD、KDⅡ-3和KDⅢ-1，对以上3种组分再次细分浓度后（5、10、30、50、80、100μg/mL）的MTT结果显示以上三种组分仍然具有显著的抑制作用。选取了KDⅢ-1和KDⅡ-3进一步细分浓度后（1、3．75、7．5、15、30μg/ml，）的MTT结果显示KDⅢ-1和KDⅡ-3组分在7．5μg/mL时的抑制率分别为63．94％和62．15％，且2种组分在1～30μg/mL。呈现剂量效应关系（r=0．694，P〈0．05；r=0．732，P〈0.05）。半数抑制浓度分别为6．65μg/mL；和10。54μg/mL，KDⅡ-3的生长曲线显示药物的各个浓度（1、3．75、7．5、15、30μg/mL）对肿瘤细胞均有抑制作用，以24h的抑制作用最为明显。在7．5-15μg/mL浓度范围内呈现明显抑制作用。结论：分离纯化的10组分对U251细胞有不同程度的抑制作用，无以KDⅡ-3的抑制作用最为显著，并有明显的剂量效应关系。

眼镜蛇毒MP成分与大鼠大脑皮层及心肌M受体结合的亚型选择性研究

目的初步了解眼镜蛇毒MP成分与M受体结合的亚型选择性。方法制备大鼠大脑皮层组织和大鼠心肌组织两种M受体膜蛋白底物。采用放射配体结合法,分别测定眼镜蛇毒MP成分对[3H]QNB与这两种膜蛋白底物结合的抑制百分率和IC50值,分析MP与M受体结合的亚型选择性。结果 MP均能完全抑制[3H]QNB与这两种膜蛋白底物的结合。大鼠大脑皮层组中,MP的抑制行为呈两相式:第Ⅰ相的抑制率为25%,IC50=0.4 nmol·L-1;第Ⅱ相的抑制率为100%,IC50=248.8 nmol·L-1。心肌组MP的IC50值为22.1 nmol·L-1,约为皮层组第Ⅰ相的55倍、第Ⅱ相的1/10。结论 MP对M受体的结合具有亚型选择性。

眼镜蛇蛇毒因子与大鼠中性白细胞吞噬功能减退的量效研究

:研究中华眼镜蛇的蛇毒因子(CVF)与中性白细胞吞噬功能的量效关系及CVF在非协调性异种心脏移植应用中的意义。方法:①用不同剂量的CVF腹膜腔内注射(i.p.)SD大鼠,测定大鼠血液中性白细胞噬菌率;②经CVFi.p.处理后大鼠进行颈部豚鼠—大鼠异种心脏移植,然后测定移植前后大鼠不同时点的血液中性白细胞噬菌率。结果:①CVF能使大鼠血液中性白细胞噬菌功能减退,并呈量效关系;②经CVF处理的大鼠移植后无发生超急排斥反应(HAR),且血液中性白细胞噬菌率明显减退,至术后3d内仍未恢复。结论:①CVF有抑制中性白细胞噬菌功能,且呈量效关系;②CVF可抑制非协调性异种心脏移植的HAR,测定中性白细胞噬菌功能是一种简便测定CVF体内抗补体活性的方法。