中华眼镜蛇毒神经生长因子对PC12细胞κ阿片受体蛋白质表达的影响

目的探讨中华眼镜蛇毒(Naja Naja Atra)神经生长因子(nNGF)对PC12细胞κ阿片受体蛋白质表达的影响。方法PC12细胞分为正常对照组和给药组,采用Western blot方法检测各组PC12细胞κ阿片受体蛋白质的表达。结果①nNGF的25、50、100μg.L-13个剂量中,50和100μg.L-1nNGF下调PC12细胞κ阿片受体蛋白质的表达,50μg.L-1剂量组下调最明显(P<0.01),100μg.L-1剂量组下调(P<0.05)。②50μg.L-1nNGF分别处理PC12细胞1、3、5、7、10 d后,其κ阿片受体蛋白质表达呈降低趋势,其中d 5、7下调(P<0.05),d 10下调明显(P<0.01)。③10μmol.L-1吗啡可上调PC12细胞κ阿片受体蛋白表达,而10μmol.L-1纳络酮对其无影响,二者分别都能逆转nNGF的下调效应,但是二者共存时不能逆转nNGF的下调效应。结论nNGF诱导PC12细胞分化中,可引起PC12细胞κ阿片受体蛋白质表达的下调效应,该效应能被吗啡或纳络酮逆转,但二者共存不能被逆转效应。

眼镜蛇毒神经生长因子诱导人鼻咽癌CNE-2细胞凋亡作用的研究

目的:研究广西眼镜蛇毒神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖的抑制作用和诱导细胞凋亡。方法:应用三磷酸腺苷-生物荧光肿瘤化疗药物敏感试验法(ATP-TCA法)测定不同质量浓度(0.0125,0.025,0.05,0.1,0.2g.L-1)NGF处理24,48,72,96h对人鼻咽癌CNE-2生长的抑制率;Hoechst33342荧光染色观察凋亡细胞的形态;琼脂糖凝胶电泳测定DNA断裂状况;流式细胞术检测细胞周期变化和细胞凋亡率。结果:不同浓度的NGF能抑制CNE-2细胞增殖,并呈浓度-时间效应关系,作用24,48,72,96h的半数抑制浓度(IC50)分别为0.213,0.095,0.048,0.033g.L-1;经NGF(0.1g.L-1)处理细胞48h后,荧光染色呈现典型的细胞凋亡形态学特征;DNA凝胶电泳可见凋亡细胞特有的DNA片段;0.05,0.1,0.2g.L-1NGF作用48h后,CNE-2细胞被阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率分别为(28.2±2.0)%、(39.9±1.9)%、(50.3±1.3)%。结论:NGF通过诱导人鼻咽癌CNE-2细胞凋亡而产生抗鼻咽癌活性。

中华眼镜蛇毒神经生长因子的研究

采用ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ和ＳｅｐｈｏｓｉｌＣ８以及ＨＰＬＣ层析方法，自广西产中华眼镜蛇毒中分离纯化神经生长因子（ＮＧＦ），此ＮＧＦ经８ｄ鸡胚背根神经节体外培养证明具有促进神经纤维生长的活性。经ＨＰＬＣ及聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一组成，经ＳＤＳＰＡＧＥ及ＨＰＬＣ测定分子量分别为２４．１ＫＤ和２４．９ＫＤ，等电聚焦电泳测得ｐＩ为８．２，氨基酸组分分析表明ＮＧＦ含酸性氨基酸较少，通过１２５｜标记ＮＧＦ测定出ＮＧＦ在生物体内主要分布于肾、肺。

中华眼镜蛇毒神经生长因子对鸡胚背根神经节及PC1-2细胞作用的观察

目的 采用国际上常用的两种测定神经生长因子活性方法对中华眼镜蛇毒神经生长因子活性作用进行观察。方法 鸡胚背根神经节培养法 ,PC12细胞培养法。结果 鸡胚背根神经节培养法在样品浓度达 5 0ng/ml时有活性反应 ,PC12细胞培养法在定性测定 ,样品浓度为 2 0ng/ml时能观察到活性 ,在用定量测定方法时 ,实验组 ( 5ng/mlNGF)细胞聚团并长出神经状纤维 ,说明有活性。结论 鸡胚背根神经节培养法灵敏度低 ,操作复杂 ,但条件要求简单。PC12细胞培养法灵敏度较高 ,但条件要求也高 ,并且需要有可靠的细胞株。

舟山眼镜蛇毒神经生长因子的亲和层析分离

用层析和制备SDS-PAGE法纯化舟山眼镜蛇(Najanajaatra Cantor)毒神经生长因子(NGF),免疫家兔获得抗血清。用辛酸-硫酸铵沉淀法初步纯化IgG,蛋白A-Sepharose亲和层析进一步纯化IgG,并与CNBr活化的Sepharose4B偶联,采用亲和层析法对舟山眼镜蛇毒神经生长因子进行分离纯化。产物经过SDS-PAGE检测呈一条带,并显示了良好的生物学活性。纯化NGF最大比活性为5.0×104U/mg蛋白,亲和常数为4.35×108L/mol,亲和层析分离NGF得率比传统分离方法得率提高35.2%,该方法为NGF的大量提取提供了技术支持。

眼镜蛇毒神经生长因子对成年猫坐骨神经损伤后的作用

目的 探讨从眼镜蛇毒分离纯化出的神经生长因子 (nerve growth factor,NGF)对成年猫坐骨神经损伤后的影响。方法 制成成年猫坐骨神经损伤模型 ,损伤局部注射蛇毒 NGF 2μg/ (kg· d) ,分别治疗 10 d和 30d,并与对照组 (损伤坐骨神经 ,不给药物 )比较。结果 术后 10 d,对照组术侧远端神经纤维数量比治疗组明显减少(P<0 .0 1) ,治疗组术侧足底刺激出现早 ,肢体活动恢复快。术后 30 d,治疗组术侧远端神经纤维大量再生 ,再生神经纤维数量已明显超过对照组和术后 10 d组水平 (P<0 .0 1) ,但结构紊乱 ,轴突和郎氏结消失。术侧肢体在连续注射 NGF 16 d左右出现足底刺激反应消失 ,肢体瘫痪等改变。结论 眼镜蛇毒 NGF在神经损伤早期应用能减轻神经纤维发生的溃变 ,促进受损神经的再生与功能恢复 ;而损伤局部长时间注射蛇毒 NGF则会导致神经纤维增生过度 。

眼镜蛇毒神经生长因子对成年猫坐骨神经损伤治疗效果的实验室观察

目的 :探讨从眼镜蛇毒分离纯化出的神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)对成年猫坐骨经损伤后的影响。方法 :本实验制成成年猫坐骨神经损伤模型 ,损伤局部注射蛇毒NGF(2μg/kg/d) ,分别治疗10d和30d ,并与对照组(损伤坐骨神经 ,不给药物)比较。结果 :眼镜蛇毒NGF在神经损伤早期应用能减轻神经纤维发生的溃变 ,促进神经纤维再生。结论 :损伤局部长时间注射NGF会导致神经纤维增生过度 。

广西眼镜蛇毒神经生长因子分离纯化方法

为了得到更高纯度和活性的广西眼镜蛇毒神经生长因子(never growth factor,NGF),我们对原有的分离纯化方法进行改进。采用DEAE CL-6B离子交换柱、Sephadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S离子交换柱结合的方法进行分离。在分离纯化过程中,采用PC12细胞检验每一步所得结果中的NGF活性,并测定NGF诱导PC12细胞分化的最小浓度。经DEAE CL-6B离子交换柱、Sephadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S离子交换柱分离纯化后,得到的第二峰具有NGF活性,并且已达到电泳纯。经PC12细胞验证后,确定NGF诱导PC12细胞分化的最小浓度为0.1μg/m L。

中华眼镜蛇(Naja Naja Atra)毒神经生长因子对PC_(12)细胞κ阿片受体mRNA表达的影响

目的研究眼镜蛇毒神经生长因子(nNGF)对PC12细胞κ阿片受体mRNA表达的影响,探讨nNGF诱导PC12细胞分化的分子机制。方法用RT-PCR方法半定量地考察nNGF及κ阿片受体的一些拮抗剂和激动剂对PC12细胞κ阿片受体mRNA表达的影响。结果(1)在25,50和100 ng/mL 3个nNGF剂量组中,50和100 ng/mL nNGF显著下调PC12细胞κ阿片受体mRNA的表达。(2)50 ng/mL nNGF分别处理PC12细胞1,3,5,7,10 d后,结果显示κ阿片受体mRNA表达随时间有降低的趋势,7 d时显著下调(P<0.05),10 d时特别显著(P<0.01)。(3)10μmol/L吗啡上调PC12细胞κ阿片受体mRNA表达,并能逆转nNGF对该κ阿片受体mRNA表达的下调效应。10μmol/L纳络酮对PC12细胞κ阿片受体的表达无显著影响,也能逆转nNGF对该κ阿片受体mRNA表达的下调效应。但吗啡和纳络酮共存时不能逆转NGF对该κ阿片受体mRNA表达的下调效应。结论nNGF诱导PC12细胞分化时,能下调其κ阿片受体mRNA表达,这种下调能分别被吗啡或纳络酮逆转,但不能被吗啡和纳络酮共存时逆转。

广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子在大肠杆菌中的表达

目的采用基因工程技术,在大肠杆菌(E.coli)中表达广西眼镜蛇(黑眼镜蛇)蛇毒神经生长因子(NGF)成熟蛋白并检测其生物活性。方法将天然广西眼镜蛇蛇毒的NGF蛋白基因克隆至融合表达载体pET-40b(+)中,以C端融合了6个组氨酸的形式在E.coli BL21(DE3)通过异丙基硫代半乳糖苷诱导表达NGF蛋白。超声破菌后,将上清液经Ni^(2+)-NTA柱纯化,收集并冻干NGF融合蛋白,用蛋白印迹法分析其NGF抗原活性,并通过促PC12细胞生长法观察其生物活性。结果经蛋白印迹分析可知在38 ku处的条带具有NGF抗原活性。加入天然蛇毒NGF,生长轴突的PC12细胞为(83±3)%,重组品为(21±3)%,表明经纯化的融合蛋白具有NGF生物活力,但活性弱于天然蛇毒NGF。结论在大肠杆菌中可以表达出有活性的蛇毒NGF蛋白。

中华眼镜蛇蛇毒神经生长因子生物活性和理化性质测定

目的：控制中华眼镜蛇蛇毒神经生长因子产品质量，研究其理化性质及生物学活性的定性和定量。方法：通过离子交换色谱、凝胶过滤及FPLC色谱分高纯化得到中华眼镜蛇蛇毒神经生长因子，按国家新药审批有关要求对其进行了SDS－PAGE电泳，N端蛋白质序列规定，HPLC色谱分析，UV光谱图谱扫描，并利用PC12细胞培养法和鸡胚背根神经节培养法检测其生物活性。结果：电泳为一条带，亚基分子量为13500，N端蛋白质序列测定后确证为神经生长因子（NGF），HPLC为单峰，相对百分含量为95％以上，279．6nm处呈现出蛋白质样特征吸收峰。生物活性测定为，PC12细胞培养法灵敏度可达1ng／ml，鸡胚背根神经节培养法需30ng／ml的浓度梯度才能在神经节上有所反应。结论：此实验样品为具有较高生物活性的高纯度NGF多肽。

中华眼镜蛇蛇毒神经生长因子在大鼠体内分布的研究

中华眼镜蛇蛇毒神经生长因子经125I标记后从大鼠舌静脉注入，2h后观察其在体内的分布。结果显示：主要分布在肾、肺、肝等脏器及周围神经，脑、喷球及脊髓的含量几乎为零。肾组织含量最高，占72％，说明代谢物主要经肾组织从尿中排除。

广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子基因在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子(NGF)基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NGF,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法:采用RT-PCR的方法扩增蛇毒NGF的基因片段,将目的基因、真核表达载体pcDNA3.1(-)分别酶切后回收,连接、转化而构建重组表达载体pcDNA3.1(-)-NGF,经酶切和测序对重组体进行鉴定。利用脂质体Lipofectamine～(TM) 2000方法转染NIH3T3细胞,对阳性克隆裂解上清中NGF的表达用SDS-PAGE、Western-blot的方法检测。结果:重组载体经酶切、测序分析,插入的基因片段为表达蛇毒NGF的基因,NGF基因在NIH3T3细胞中获得表达。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-NGF,并检测出在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步开展NGF基因治疗神经系统的疾病奠定了实验基础。

蛇毒神经生长因子的分离纯化及鉴定

采用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０、ＣＭ－Ｃｅｌｕｌｏｓｅ３２柱层析，从中华眼镜蛇中分离出神经生长因子（ＮｅｒｖｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｅｒ，ＮＧＦ）。经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ法证明所得到的ＮＧＦ为单一组分，相对分子质量约为１．３×１０４．经凝胶等电聚焦电泳测得ＮＧＦ等电点ＰＩ约为７．０左右．经ＨＰＬＣ及电泳图像分析系统测得纯度为９８％．此ＮＧＦ经８ｄ鸡胚背根神经节体外培养证明，具有促进神经纤维生长的活性．将所纯化的ＮＧＦ免疫大白兔获得抗血清。

眼镜蛇毒因子对神经病理性疼痛干预效应的实验研究

目的:观察眼镜蛇毒因子(CVF)对慢性坐骨神经压迫损伤(CCI)大鼠痛阈和脊髓补体表达的影响,探讨补体异常活化在神经病理性疼痛(NPP)中的作用。方法:SD大鼠随机分为假手术+等渗盐水组(对照组)、CCI+等渗盐水组、CCI+CVF组。CCI+等渗盐水组和CCI+CVF组采用经典坐骨神经结扎术,建立CCI模型,对照组仅暴露坐骨神经而不结扎,CCI+CVF组在坐骨神经结扎后第4d经尾静脉注射50μg/kg的CVF。各组分别于术前和术后3、7、11和14 d记录热痛阈值和机械痛阈值,并测定血清和脊髓中补体蛋白C3的表达。结果:与对照组比较,CCI+等渗盐水组及CCI+CVF组大鼠于术后3 d出现明显机械性痛觉超敏和热痛觉过敏(P<0.01);与CCI+等渗盐水组相比,CCI+CVF组大鼠在尾静脉注射CVF后热痛敏和机械痛敏明显减轻(P<0.01),但随着药效的衰减,痛觉过敏又逐渐恢复。和痛阈变化一样,血清和脊髓补体C3水平在CVF干预后显著下降,随着药效的减弱又逐渐恢复,而等渗盐水治疗组无此变化。结论:尾静脉注射CVF具有减轻NPP大鼠机械痛敏和热痛敏的作用,补体C3活化状态可能与NPP疼痛和CVF镇痛效应有重要关系。

眼镜蛇毒因子对神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经元的保护效应

目的观察眼镜蛇毒因子(CVF)对慢性坐骨神经损伤(CCI)后大鼠脊髓背角神经元的保护效应。方法 36只SD大鼠随机均分成三组,CCI+生理盐水(CS组)、CCI+CVF 50μg/kg(CC组)和尾静脉注射生理盐水(SS组)。于术前和术后1、3、5、7 d测定大鼠的热痛阈值和机械痛阈值,并于术后7 d处死大鼠取脊髓组织,在电镜下观察脊髓背角神经元的内部结构变化,并测定脊髓匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)吸光度。结果与SS组相比,CS组大鼠热痛阈值和机械痛阈值降低,脊髓匀浆中SOD活力明显降低,而MDA显著升高(P<0.05);与CS组相比,CC组大鼠热痛阈值和机械痛阈值升高,脊髓匀浆中SOD活力明显升高,而MDA却迅速下降(P<0.01)。给予CVF后,CCI大鼠脊髓背角神经元线粒体的肿胀程度减轻。结论 CVF能减轻CCI后脊髓背角神经元的损伤程度,可能与其减少自由基和脂质过氧化的损伤有关。

眼镜蛇毒中神经再生因子和神经毒素的分离

本研究采用Sephadex G-100柱层析,用中性Tris-HCl缓冲液洗脱,分离眼镜蛇全毒.结果不仅有效地分离出神经再生因子和神经毒素,而且保持了各自的生物活性.

江西眼镜蛇毒神经毒素的提纯及部分性质鉴定

采用CM SephadexG5 0和SP SephadexG5 0两次柱层析 ,从江西眼镜蛇毒中分离提纯得到电泳纯的神经毒素 ,它对大鼠膈神经膈肌标本及清醒家兔具有典型的箭毒样作用 ,小鼠sc的LD50 为 5 3μg/kg ,等电点为 pH8 8,相对分子质量为 6 80 0～ 70 0 0 。

眼镜蛇毒组分抑制人神经胶质瘤U251细胞增殖及其机制研究

目的:探讨眼镜蛇毒组分对人神经胶质瘤U251细胞增殖抑制作用及其机制。方法:采用MTT法比较各种蛇毒组分对U251细胞增殖的抑制效果并筛选出高效组分,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期,激光共聚焦显微镜和电子显微镜观察蛇毒组分作用U251细胞后的形态学变化。结果:11种眼镜蛇毒组分对体外培养的神经胶质瘤细胞U251均有不同程度的生长抑制作用,其中组分KDⅡ-3对肿瘤细f胞的抑制作用呈现剂量和时间依赖性。不同浓度(1、3.75、7.5、15 mg/L)KDⅡ-3作用细胞24 h后,其凋亡率分别为13.3%、17.7%、20.0%、22.4%,且可见到"亚G1期"峰。KDⅡ-3还将U251的细胞周期阻滞在G0/G1期。7.5 mg/L KDⅡ-3作用U251细胞24h后激光共聚焦显微镜观察显示细胞膜皱缩,染色质浓缩、碎裂,透射电镜观察显示细胞核固缩,染色质凝聚。结论:眼镜蛇毒组分KDⅡ-3可抑制神经胶质瘤细胞U251的增殖,促进细胞凋亡。