湖南眼镜蛇毒蛋白质和几种金属元素含量的测定

本文报道以常规方法测定人工饲养湖南眼镜蛇(Naja naja atra)毒中的蛋白质含量、灰分等,用原子吸收光谱法测定该毒中的Ca、Mg、Zn、Cu、Fe、Mn、Pb和Cr的含量。

眼镜蛇神经毒素急性毒性试验

目的：观察眼镜蛇毒神经毒素（科博肽注射液）的急性毒性,为药物的临床安全使用提供依据。方法：选取3个批次的眼镜蛇毒神经毒素（样品1、2、3）,通过预实验设计各样品组数和剂量,分别给每组小鼠一次性肌肉注射相应批次和剂量的眼镜蛇毒神经毒素,观察给药后14 d内各受试小鼠的反应、死亡情况及主要脏器有无明显病理改变;Bliss法计算出各样品的半数致死量（LD50）及其95%可信限。结果：小鼠肌肉注射眼镜蛇毒神经毒素注射液后,部分小鼠从出现右后肢（给药侧）跛行,逐渐发展至全身肌张力降低,出现呼吸减慢,最后死亡,部分小鼠症状持续约2~6 h后开始缓解并逐渐恢复正常,尸检结果显示各脏器肉眼观察均未见明显异常;3个批次的眼镜蛇毒神经毒素经LD50及其95%的可信限分别为：样品1 LD50为202.097μg/kg,95%的可信限为174.358~234.249μg/kg;样品2 LD50为146.425μg/kg,95%的可信限为132.904~161.322μg/kg;样品3 LD50为160.726μg/kg,95%的可信限为138.863~186.030μg/kg。结论：眼镜蛇毒神经毒素注射液具有一定急性毒性,且其毒性作用可能主要累及肌肉神经系统。

眼镜蛇毒中锌与蛋白质含量的相关性研究

对几批眼镜蛇（Ｎ．ｎａｊａａｔｒａ）毒样品，用紫外分光光度法和原子吸收分光光度法分别测定其中的蛋白质和锌的含量，首次发现该毒中的锌与蛋白质含量呈负相关。经相关系数检验，Ｐ＜０．０１，即具有良好的线性相关。

眼镜蛇长链神经毒素镇痛效应及可能机制

目的探究眼镜蛇长链神经毒素(CBT)的镇痛作用及可能机制。方法采用在体细胞外记录方法记录慢性炎症痛模型大鼠脊髓背角神经元的痛诱发放电,分别对六组实验大鼠注射生理盐水(5μL)、CBT(20、40、80 ng/kg)、阿托品(2 mg/kg)、阿托品(2 mg/kg)+CBT(40 ng/kg),观察不同含量CBT对脊髓背角神经元痛诱发放电的影响,同时观察胆碱能受体拮抗剂阿托品能否翻转其镇痛效应。结果不同含量CBT均可以显著抑制慢性炎症痛大鼠脊髓背角神经元的痛诱发放电,各含量CBT组放电频率与生理盐水组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),且该效应可被阿托品所阻断,阿托品+CBT组在20、30、40、50、60 min放电频率与CBT(40 ng/kg)组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论CBT具有显著的镇痛效应,该效应有一定的剂量依赖性,胆碱能受体系统参与了其镇痛过程。

中华眼镜蛇α-神经毒的纯化及其在烟碱型乙酰胆碱受体纯化上的应用

目的从中华眼镜蛇粗毒中分离纯化其α-神经毒组分,并将此α-神经毒作为亲和层析的配基纯化烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)。方法采用凝胶过滤层析、阳离子交换层析逐步分离纯化中华眼镜蛇粗毒,通过125I-α-银环蛇毒素(αBtx)-nAChR结合抑制实验检测蛋白活性,SDS-PAGE检测蛋白的相对分子质量和纯度;亲和层析纯化nAChR,放射免疫沉淀法测nAChR活性。结果从5g中华眼镜蛇粗毒中共纯化得到约20mg眼镜蛇α-神经毒,该眼镜蛇α-神经毒有一定的125I-αBtx-nAChR结合抑制活性,其半数抑制浓度(IC50)约为αBtx的28倍。以纯化的α-神经毒制备的亲和介质,可吸附大鼠骨骼肌肌膜提取物中约84%的125I-αBtx结合活性,且此活性可以被0.2mol/L卡巴胆碱洗脱。结论用简单的液相色谱方法可从中华眼镜蛇毒中分离纯化α-神经毒,并且可以以其为配体从大鼠骨骼肌中纯化nAChR。

鞘内注射ω-芋螺毒素SO3对CCI大鼠脊髓及坐骨神经iNOS蛋白表达的影响

目的通过检测鞘内注射ω-芋螺毒素SO3对坐骨神经慢性挤压伤(CCI)模型大鼠脊髓及坐骨神经诱生型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达的影响,探讨慢性神经痛发展过程中Ca2+对iNOS的作用。方法雄性SD大鼠40只,随机分为4组(n=10):N组为正常对照组,C组为CCI后14天组,CN组为CCI7天后连续鞘内注射生理盐水7天组,CS组为CCI7天后连续鞘内注射ω-芋螺毒素SO3(30ng/h)7天组。用Western blot方法检验各组动物脊髓及坐骨神经结扎部位中段和远端iNOS蛋白表达量的变化。以GAPDH表达量作为内参照。结果正常大鼠脊髓及坐骨神经标本未见iNOS表达,CCI大鼠结扎侧坐骨神经及同侧脊髓均有较强的iNOS表达,持续鞘内注射ω-芋螺毒素SO3后此种表达减弱。结论CCI大鼠脊髓和受损坐骨神经iNOS表达增加,鞘内注射ω-芋螺毒素SO3可降低CCI大鼠上述部位iNOS表达。在慢性神经痛的发展过程中,Ca2+通道阻滞剂对iNOS的表达有一定作用。

福建产眼镜王蛇毒神经毒素的分离及活性测定

目的 从眼镜王蛇蛇毒中分离神经毒素 ,测定其活性和毒性。 方法 应用 CM- Sephadex C- 5 0离子交换色谱 ,阶段梯度洗脱分离粗毒 ;用 Sephadex G- 5 0凝胶过滤纯化组分 ;用大鼠体外膈神经 -膈肌标本鉴定分离组分对神经 -肌肉接头的作用性质 ;观察神经毒素对乙酰胆碱 (Ach)引起蛙体外腹直肌收缩的量效曲线的影响 ;以Meier法测定神经毒素对小鼠的半数致死量 (L D50 )。 结果 眼镜王蛇粗毒经阳离子交换色谱后获得 A～ N共 1 4个蛋白峰 ,经鉴定 E、F、G、H、I、K等 6个蛋白峰具有阻断神经 -肌肉接头传导的作用 ,被鉴定为神经毒素 ,约占粗毒的 4 8.3% ;通过凝胶过滤对 E、G和 K组分进行初步纯化 ;E、G和 K组分可使 Ach引起的蛙腹直肌收缩的量效曲线平行右移 ,它们与 N2 -胆碱受体 (N2 - Ach R)的解离常数 (KD)分别为 :1 4 5 .87,73.5 3和 2 0 .0 4 ng/ m L;E、G和 K组分小鼠静脉注射的 L D50 分别为 :0 .884 ,0 .74 9和 1 .5 8mg/ kg。 结论 眼镜王蛇粗毒经离子交换色谱获得 6个神经毒素组分 ,经鉴定 E、G和 K组分为 N2 - Ach

广西境内两种常见神经毒类毒蛇咬伤中毒的临床特点与院前急救策略分析

目的分析广西境内两种常见神经毒类毒蛇咬伤中毒的临床特点,总结其院前急救策略,为临床提供参考。方法选择2007—2012年在我科急诊抢救与住院的102例眼镜王蛇与银环蛇咬伤中毒患者,根据咬伤蛇类将患者分为眼镜王蛇组35例和银环蛇组67例,对比两组患者的院前急救措施、就诊时间、出现呼吸肌麻痹时间、伤情分级、临床表现、呼吸机治疗情况、预后情况及院外与院内死亡率等。结果两组患者的性别、年龄、院前急救措施及就诊时间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。眼镜王蛇组危重型患者所占比例高于银环蛇组(80.00%和58.21%,P=0.028)。两组患者均出现了全身症状,眼镜王蛇组局部肿痛发生率(8.57%和0,P=0.015)、多器官功能障碍综合征(MODS)发生率(20.00%和5.97%,P=0.030)高于银环蛇组,出现呼吸肌麻痹时间短于银环蛇组〔(3.8±2.2)h和(7.1±8.4)h,P=0.042〕。眼镜王蛇组治愈率低于银环蛇组(77.14%和95.52%),死亡率高于银环蛇组(22.86%和4.48%),且眼镜王蛇组院外死亡率高于银环蛇组(11.43%和1.49%,P=0.027)。结论相对于银环蛇,被眼镜王蛇咬伤患者病情更为凶险,出现呼吸肌麻痹的时间更短,MODS发生率及院外死亡率更高,医务工作者应充分认识呼吸机辅助呼吸治疗的关键性,加强神经毒类毒蛇咬伤院前急救策略的宣教。

眼镜蛇毒MP成分对离体豚鼠回肠的收缩作用及与磷脂酶A_2活性的关系

目的探讨温度和磷脂酶A2抑制剂甲基二十碳二烯酸(DEDA)对眼镜蛇毒MP成分收缩离体豚鼠回肠作用的影响,阐明MP成分的药理作用是否依赖其磷脂酶A2(PLA2)活性。方法利用卵磷脂水解法测定在27℃和37℃下MP成分的PLA2活性;分别测定在27℃和37℃下MP成分及卡巴胆碱收缩豚鼠回肠纵行肌作用强度并比较;将豚鼠回肠纵行肌标本在浴槽中预先5 min加入PLA2抑制剂DEDA 100μmol·L-1,再测定MP成分及卡巴胆碱收缩豚鼠回肠纵行肌的作用强度,分别观察DEDA对MP成分及卡巴胆碱收缩豚鼠回肠纵行肌作用强度的差异。结果 MP成分在27℃下水解卵磷脂的酶活性仅为37℃时的55%,具有显著性差异(P<0.01)。离体实验显示,27℃和37℃组间MP成分及卡巴胆碱收缩豚鼠回肠的作用强度均不存在明显差异。与对照组相比,DEDA干预组MP成分及卡巴胆碱收缩豚鼠回肠的作用强度均无明显差异。结论 MP对豚鼠回肠纵行肌的收缩作用与其PLA2活性不存在直接相关。

内毒素诱导的细胞内信息转导

Depending on LBP/CD14 systems, LPS activates a series of signal-transducing systems in cells. Protein tyrosin kinase(PTK)system,ceramide activated kinase(CAK)system might play an important role in cells signal-transducing.This article give a summary about signal transduction in cells induced by endotoxin.

舟山眼镜蛇毒α-神经毒素致突变性研究(英文)

目的对舟山眼镜蛇毒α-神经毒素的致突变性进行研究,为临床应用的安全性提供依据。方法应用中国仓鼠肺成纤维细胞CHL染色体畸变试验和Ames试验检测舟山眼镜蛇毒α-神经毒素是否有致突变性。结果 Ames试验:对于突变株TA97、TA100和TA102,α-神经毒素浓度达到或者超过2.56μg·m L-1,Ames试验阳性(P<0.05);对于突变株TA98,α-神经毒素浓度达到或者超过5.12μg·m L-1,Ames试验阳性(P<0.05)。但回复突变和畸变率与神经毒素的浓度不呈线性关系,也与是否有活化剂S9无关联。染色体畸变试验:α-神经毒素浓度达到或者超过0.64μg·m L-1,CHL细胞染色体畸变为阳性(P<0.05),但畸变率与神经毒素的浓度不呈线性关系,也与是否有活化剂S9无关联。结论舟山眼镜蛇毒α-神经毒素临床剂量为1μg·kg·d-1时在致突变性上是安全的。

虎纹捕鸟蛛毒素-ILys13突变对生物学活性的影响

从虎纹捕鸟蛛Selenocosmia(Ornithoctonus)huwena的粗毒中分离纯化出来的虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ(HWTX-Ⅰ)是一种多肽类神经毒素。为了进一步探明其结构与功能的关系,采用以固相多肽合成为核心技术的蛋白质工程方法直接构建了Ala取代Lys13的单残基突变体K13A-HWTX-Ⅰ,并同时合成了HWTX-Ⅰ的全序列sHWTX-Ⅰ作实验对照。合成产物经质谱和序列分析鉴定无误后在含谷胱甘肽的缓冲体系中氧化折叠并用离子交换和RP-HPLC纯化。活性测定结果表明,氧化复性后,sHWTX-Ⅰ与天然HWTX-Ⅰ的生物学活性完全相同,而K13A-HWTX-I的生物学活性下降了87％,提示Lys13是与HWTX-Ⅰ的生物学活性密切相关的重要残基。

ω-芋螺毒素MVIIA/虎纹捕鸟蛛毒素-I嵌合体HM-1227的合成及活性测定

用Fmoc固相多肽合成的方法手工合成了一种ω 芋螺毒素MVIIA和虎纹捕鸟蛛毒素 I的嵌合体HM 1 2 2 7,经过RP HPLC纯化和氧化复性 ,小鼠隔神经 隔肌标本的阻断实验显示此嵌合体能实现二硫键完全配对与稳定折叠并具有微弱的神经毒活性 .实验结果表明 ,ω CtxMVIIA和HWTX I的分子框架稳定 ,部分序列交换后仍能实现二硫键配对与折叠 。

破伤风毒素C端片段与心肌营养素-1融合蛋白表达、纯化与靶向神经元逆向运输及神经营养活性鉴定

目的在BL21（DE3）大肠杆菌中表达破伤风毒素C端片段（TFC）与心肌营养素（CT）-1融合蛋白并纯化。探讨TTC转导结构域对CT-1的靶向神经元逆向运输活性与CT．1的神经营养活性。方法异丙基-B—D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导BL2（DE3）大肠杆菌表达CT-1／TYC融合蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）与WB法鉴定融合蛋白表达。制备SD大鼠坐骨神经损伤模型，分别经神经再生室、肌肉注射给药，自由放养1周后处死，4％多聚甲醛灌注固定，取脊髓L4～L6腰膨大标本，冰冻切片，免疫组织化学检测。制备新生6～7d龄sD大鼠坐骨神经损伤模型，肌肉注射CT-1／TTC融合蛋白，自由放养1周后处死，4％多聚甲醛灌注固定，取L4～L6腰膨大标本，冰冻切片，尼氏染色计数脊髓前角运动神经元。结果原核表达目的蛋白CT-1／TTC表达量占全菌蛋白总量的15％，以可溶性蛋白为主。通过谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签亲和纯化获得2.7g／L的CT-1／TTC重组融合蛋白。免疫组织化学于脊髓腰膨大检测到CT-1／TTC融合蛋白。坐骨神经损伤后，脊髓L4-L6腰膨大前角运动神经元计数较CT-1／TTC融合蛋白处理组减少，存活率下降。结论基因重组CT-1／TTC蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，所获得的融合蛋白有靶向性脊髓神经元细胞的活性和对损伤后运动神经元的神经营养活性。

重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin在毕赤酵母中的表达及其活性

目的利用毕赤酵母表达系统表达BoNT-LH(N)-Elafin融合蛋白,并检测其生物学活性。方法构建pPIC9K-BoNT-LH(N)-Elafin重组真核表达质粒,转化毕赤酵母GS115菌株,甲醇诱导表达,取上清,经阳离子交换层析纯化融合蛋白,并检测其反应原性、抗弹性蛋白酶活性及对SNARE蛋白复合体的裂解作用。结果重组表达质粒pPIC9K-BoNT-LH(N)-Elafin经双酶切及测序证实构建正确;表达的BoNT-LH(N)-Elafin融合蛋白相对分子质量约为110 000,纯化的融合蛋白纯度达92%,浓度为54 mg/L,反应原性良好,具有抗弹性蛋白酶活性及裂解SNARE蛋白复合体的作用。结论已在毕赤酵母GS115中成功表达了重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin,该融合蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究其抑制气道黏液高分泌的机制奠定了基础。