睡美人转座子在草鱼CIK细胞中介导的高效基因整合

为研究睡美人(Sleeping Beauty,SB)转座子系统在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾脏细胞(CIK)中介导的整合特性,构建了SB转座子和转座酶在两个质粒的二元反式(trans)转座子系统,以及转座子和转座酶元件在同一个质粒的一元顺式(cis)转座子系统;通过转染CIK细胞,用荧光显微镜、流式细胞仪和荧光定量PCR分析了转染2d后及嘌呤霉素筛选4周后的细胞,测定Ds Red转染效率和整合效率,并结合高效热不对称交互式PCR扩增获得SB转座子整合位点的序列。结果表明,SB二元转座子系统的整合效率远高于一元系统;SB转座子与转座酶比例为1鲶2时,外源基因Ds Red的整合效率最高;SB转座子偏向于插入草鱼基因组TA序列处。研究表明优化SB转座子和转座酶的比例能提高外源基因在草鱼细胞中的整合效率并快速获得突变细胞,同时为在鱼类细胞中采用SB转座子建立突变体文库提供理论基础。

“睡美人”转座子的研究进展

“睡美人(Sleeping Beauty,SB)”转座系统是Tc1/mariner转座子超家族中的一员,已经失活了一千多万年。1997年,Ivics等根据积累的系统发生数据,利用生物信息学的方法,对其进行分子重建,终于唤醒了其转座活性。近年来对“睡美人”转座系统的转座效率和转座机理进行的研究,已证明SB转座子在基因筛选,转基因及基因治疗等领域具有广阔的应用前景。文章重点论述了SB转座子在结构及其优化、转座机制和应用等方面的进展,同时对其研究中出现的各种问题进行了总结并提出了一些解决方案。

腺病毒介导的“睡美人”转座子与IL-10共表达对NOD小鼠Th17/Treg细胞平衡的影响

目的:观察腺病毒介导的"睡美人"(SB)转座子与白细胞介素10(IL-10)共表达对非肥胖糖尿病(NOD)小鼠脾细胞中Th17/Treg细胞平衡的影响,阐明IL-10对NOD小鼠的可能治疗机制。方法:提取C57BL6小鼠的脾细胞并培养,将脾细胞分为对照组、空载体组和治疗组。对照组脾细胞不做任何处理,空载体组将不含IL-10基因而有转座子序列的腺病毒载体和不含转座酶的腺病毒载体共同感染小鼠脾细胞,治疗组将含有IL-10基因和转座子序列的腺病毒载体以及含有转座酶的腺病毒载体共同感染小鼠脾细胞。感染48h后RTPCR法检测各组小鼠脾细胞中IL-10mRNA表达水平。感染48h后将上述3组处理的脾细胞分别种植到对照组、空载体组和治疗组NOD小鼠右后腿的腘窝皮下,每组6只小鼠,每周注射1次,共6次。注射结束后4周处死小鼠,ELISA法检测各组NOD小鼠血清中IL-10表达水平;流式细胞术检测各组NOD小鼠脾细胞中CD4+IL-10+、CD4+IFN-γ+、Th17和Treg细胞的比例。结果:与对照组和空载体组比较,治疗组C57BL6小鼠脾细胞中IL-10mRNA表达水平明显升高(F=72.71,P<0.05),NOD小鼠血清中IL-10表达水平明显升高(F=8.89,P<0.05),NOD小鼠脾细胞中CD4+IL-10+细胞和Treg细胞比例明显升高(F=72.09,P<0.05;F=12.98,P<0.05);但治疗组小鼠脾细胞中Th17细胞比例明显下降(F=6.39,P<0.05);NOD小鼠脾细胞中CD4+IFN-γ+细胞比例在对照组、空载体组和治疗组之间比较差异无统计学意义(F=2.72,P>0.05)。结论:腺病毒介导的SB转座子与IL-10共表达后可以升高NOD小鼠血清中IL-10表达水平;同时可明显升高NOD小鼠脾细胞中CD4+IL-10+细胞比例,降低Th17细胞比例,升高Treg细胞比例,调控Th1/Th2和Th17/Treg的平衡,对NOD小鼠起到治疗作用。

“睡美人”转座子系统研究进展

转座子在脊椎动物中的应用远落后于在其他生物系统中的应用。“睡美人”转座子(sleeping beauty transposon)是Tc1/mariner转座因子超家族中的一员,是存在于鲑鱼基因组中的1个已经失活的转座子。1997年,Ivics等将这个转座子进行重建并恢复了它的活性。短短几年内的有关研究表明,“睡美人”转座子是目前在脊椎动物中转座活性最高的转座子。结合该转座子系统逐步显示出的广阔应用前景,本文重点论述了其结构、转座机制及应用,并提出了应用“睡美人”转座子系统须注意的问题。

用Sleeping Beauty转座子筛选肺癌相关基因及功能研究

目的探讨睡美人(SB)转座子筛选肺癌相关基因的应用。方法采用Sleeping Beauty转座子插入T2/Onc盒子(T2/Onc cassette)诱变人支气管上皮细胞(HBEC)的模型,挑选阳性克隆,高通量测序筛选共同插入位点(CIS)及候选基因。在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系NCI⁃H1299中验证筛选出的COL11A1基因功能,采用CCK⁃8细胞增殖实验等检测NCI⁃H1299细胞系敲低COL11A1前后的增殖能力及其对顺铂的敏感性变化,采用Transwell细胞迁移、侵袭实验比较其迁移、侵袭能力变化。结果使用转座子筛选中通用的蒙特卡洛模拟法确定CIS,以P<0.05为界,共找到252个CIS,包括675个候选基因。结果显示,筛选出的COL11A1基因可以促进NCI⁃H1299细胞系增殖(P<0.01)、迁移(P<0.001)、侵袭(P<0.001)并介导其顺铂耐药(P<0.001)。结论本研究证明了使用SB转座子插入T2/Onc诱变HBEC的模型能够很好地筛选出肺癌相关基因,并证实了COL11A1可以促进NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭并介导顺铂耐药及上皮间质转换。

SB转座子介导的hLF乳腺表达载体的构建及鉴定

构建了以睡美人(Sleeping beauty,SB)转座子为载体元件、β-乳球蛋白质(β-lactoglobulin,BLG)为调控区的人乳铁蛋白质(Human lactoferrin,hLF)乳腺表达载体及增强型绿色荧光蛋白质(EGFP)表达载体,便于验证SB转座子的转座效率,为hLF乳腺表达载体成功转染乳腺上皮细胞(GMC)奠定基础。采用PCR法从绵羊基因组中扩增5'、3'BLG,经TA克隆,在中间载体pcDNA3.1(-)的作用下,与hLF连接,得到pcDNA3.1(-)-BLG-hLF,然后与pT2连接,构建pT2-BLG-hLF;此外,还构建了pT2-BLG-EGFP。采用测序、酶切、PCR 3种方法鉴定阳性克隆,并用脂质体法将pT2-BLG-EGFP转染至GMC细胞中进行观察。分子鉴定结果:5'BLG、3'BLG克隆成功,pT2-BLG-hLF及pT2-BLG-EGFP构建正确;细胞鉴定结果:SB转座子介导的EGFP能在GMC细胞中高效表达。成功克隆了5'BLG、3'BLG调控区,并成功构建了乳腺表达载体pT2-BLG-hLF。

低温电转联合Sleeping beauty转座子系统增强CAR-T修饰效率

嵌合抗原受体T淋巴细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T cells)在恶性B淋巴细胞瘤治疗上取得了显著成效。CAR-T治疗通过分离病人外周血单个核细胞PBMC,经适当的基因编辑手段表达CAR结构,令T细胞获得靶向肿瘤细胞的能力,扩增后过继到体内完成对肿瘤的杀伤。该文主要探索在低温状态将含有睡美人(Sleeping beauty)转座子/转座酶系统的质粒电转进PBMC内表达CD19-CAR制备CAR-T细胞,并添加特定细胞因子进行增殖,并验证CAR表达、细胞活性与杀伤能力。结果表明,转染效率高达58.8%±4.1%,增殖后的CAR-T细胞能够整合并表达CAR基因,在与靶细胞共培养后,表现出与慢病毒制备的CD19-CAR相似的细胞活性和毒性。该文确定了一种基于Sleeping beauty转座子/转座酶和电转制备CAR-T细胞的方法,为临床CAR-T治疗提供了新的思路。

高压静脉注射转染法建立脂源性炎症介导的肝癌小鼠模型

目的利用高压静脉注射转染法经小鼠尾静脉转染蛋白激酶B(AKT)、β联蛋白(β-catenin)及睡美人转座子质粒建立伴脂肪肝的炎癌转化小鼠肝癌模型并对该模型进行鉴定。方法选取6~8周龄雄性C57BL/6小鼠,通过高压静脉注射转染法在短时间内(5~9 s)经尾静脉注射含目的DNA的等渗生理溶液(20μg myrAKT、20μgΔN90-β-catenin和4μg Sleeping Beauty transposase溶于2 mL生理盐水),对照组采用相同方法注射对照质粒。于建模8、12、16周后,处死小鼠并收集血清及肝组织,提取RNA。HE染色检测肝脏组织结构及炎性细胞浸润程度;油红O染色检测肝细胞内脂质沉积情况;天狼星红和Masson染色检测肝组织纤维化程度;免疫组织化学染色检测肝组织KI-67抗原(ki67)表达显示细胞增殖活性、检测CD31表达显示微血管密度及分布情况;实时荧光定量PCR检测肝组织肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)的mRNA表达;流式细胞术检测肝组织内各免疫细胞亚群数量变化。结果小鼠经高压静脉注射转染法建模16周后,实验组小鼠成瘤率100%(20/20)。与对照组相比,实验组小鼠体质量增长缓慢,肝质量显著增加。HE染色结果显示,大量肝细胞出现脂肪变,炎性细胞浸润增多,肝癌组织内肿瘤细胞为类圆形或不规则形,核质比失调,异型性显著,呈团块状分布;ki67阳性细胞数增加。血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、γ谷氨酰转肽酶(γ-GT)、碱性磷酸酶(ALP)水平显著升高,AFP mRNA表达显著上升,CD31表达检测显示微血管密度增加且结构紊乱。流式细胞术分析肝脏中大量炎性细胞浸润,且以髓系及淋巴系为主。结论通过高压静脉注射转染法在肝细胞中激活AKT和β-catenin成功建立了伴发脂肪肝的炎癌转化小鼠肝癌模型,且方法简便,诱导时间短,成瘤率高,重复性强。

长效稳定表达杆状病毒基因传递载体的构建及表达效率研究

目的为解决杆状病毒作为基因传递载体瞬时表达缺陷,拟构建睡美人(SB)转座子介导的杆状病毒表达载体,通过检测绿色荧光蛋白EGFP的表达变化来评价该系统在哺乳动物体内外的表达效率。方法以pFastBac DUAL质粒为骨架,将pPh启动子替换为CMV-SB100X-SV40 PA表达元件,然后在其下游插入IR/DR-CMV-EGFP-SV40 PA-IR/DR表达元件,获得的质粒命名为pBacSB-CE;同时作为对照构建pBac-CE,在pPh启动子下游插入CMV-EGFP表达元件。将构建好的重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac,经蓝白斑筛选后转染Sf-9细胞,获得重组杆状病毒BacSB-CE和Bac-CE。将重组病毒转导人胶质瘤U87细胞,通过MTT、倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞的增殖以及EGFP的表达效率;建立裸鼠皮下胶质瘤肿瘤模型,通过组织免疫荧光进一步观察重组病毒在体内的转导效率。结果经PCR鉴定成功获得了重组病毒BacSB-CE和Bac-CE;MTT结果证实重组病毒对U87细胞的增殖无副作用;倒置荧光显微镜和流式结果显示,EGFP在BacSB-CE转导的U87细胞中至少能表达60 d,在转导15 d后仍能检测到约10^(9) a.u.总荧光强度,而在Bac-CE转导的细胞中,15 d后已检测不到荧光细胞和荧光信号;体内组织免疫荧光检测进一步显示BacSB-CE组在第10天时仍能检测到绿色荧光细胞,而Bac-CE组在第5天时基本看不到荧光细胞。结论该研究成功构建了SB转座子介导的杆状病毒基因传递系统,获得的重组病毒对哺乳动物细胞具有良好的安全性,并能介导EGFP在哺乳动物体内外持续稳定表达。

基因修复方法与治疗

基因修复涉及的对象是基因突变原位校正以恢复正常基因功能。具体基因修复虽然有很多限制,但与扩增技术相比还是有很多优点。本文概述了基因修复的优缺点,主要讨论了基于嵌合RNA/DNA寡核苷酸,单链寡核苷酸和小片段同源替换方法。这些方法都有一些共同点即需要核酸分子到细胞核的有效传递。此外,还有一种新的基因扩增策略—睡美人转座子系统。

转基因山羊抑制口蹄疫病毒3D基因

利用shRNA与高效的"睡美人"(sleeping beauty,SB)转座子系统生产抑制口蹄疫病毒3D基因复制的山羊.对口蹄疫病毒基因(2B,3D)shRNA抑制靶点进行筛选,构建了3条含靶基因shRNA的pLL3.7表达载体,与含靶基因的psiCheck2载体(双荧光素标记)共转染293FT细胞,对合成的shRNA进行筛选.获得的抑制效果好的3D1shRNA(干扰3D基因)插入到SB转座子载体上,将含3D1shRNA的SB转座子与转座酶(2:1,5:1,10:1)通过原核显微注射生产转基因山羊.出生羔羊进行Southern blot与整合位点鉴定,对阳性个体耳成纤维细胞转染含3D基因的pisCheck2载体,观察其抑制率.结果共获得了7只阳性山羊.SB转座子与转座酶的比例为10:1时,生产转基因山羊的效率为21.05%.阳性个体耳成纤维细胞对口蹄疫病毒3D基因有显著抑制效果.