新型纳米睫状神经营养因子复合物玻璃体腔注射对食蟹猴眼部的安全性——形态学评价

目的评估一种新型纳米神经营养因子复合物(NP-CNTFs)在非人灵长类动物眼内应用的安全性。方法利用纳米工艺制备包裹睫状神经营养因子(CNTF)的纳米粒。选取3只成年雄性食蟹猴,单眼玻璃体腔注射10μl NP-CNTFs(1μg/μl)作为NP-CNTFs组,对侧眼注射等体积磷酸盐缓冲液作为对照组。在注射前、注射后第3天和第7天,对食蟹猴行常规眼前节检查以评估结膜充血、前房闪辉及前房细胞等眼部症状并评分;采用彩色眼底照相观察眼底情况;采用频域光学相干断层扫描(SD-OCT)检测视网膜形态结构及厚度。结果所制备NP-CNTFs粒径为(317±3)nm,多分散性指数为0.042±0.015,Zeta电位为(-38.9±0.7)mV,具备较好的稳定性、生物利用度和生物相容性。眼前节检查显示,NP-CNTFs组在注射后第3天表现出较对照组稍明显的结膜充血、前房闪辉和前房细胞,但在注射后第7天基本恢复正常。NP-CNTFs组与对照组注射后第3天眼前节症状评分分别为(2.67±0.88)和(1.00±0.58)分,注射后第7天分别为(0.67±0.33)和(0.33±0.33)分,组间比较差异均无统计学意义(t=2.50、1.00,均P>0.05)。彩色眼底照相结果显示,NP-CNTFs组和对照组在注射后第7天眼底均正常,未见玻璃体混浊、玻璃体出血、视网膜出血或视盘水肿等异常改变。SD-OCT结果显示,NP-CNTFs组和对照组在注射后第7天均未见明显视网膜组织学改变。NP-CNTFs组和对照组视网膜神经纤维层厚度分别为(107.67±0.88)和(111.00±3.22)μm,黄斑中央凹厚度分别为(255.67±2.03)和(254.67±3.84)μm,组间比较差异均无统计学意义(t=1.43、0.50,均P>0.05)。结论新型纳米药物NP-CTNFs在食蟹猴眼内应用的安全性较好。

大鼠眼球和泪腺中睫状神经营养因子及其受体的组织定位

目的 观察睫状神经营养因子(CNTF) 及其受体CNTFRα在大鼠眼球、泪腺上的分布情况。方法 取雄性SD大鼠两侧眼球和泪腺, 作石蜡切片, 用免疫组织化学ABC法染色检测眼球、泪腺中CNTF和CNTFRα的免疫阳性反应。结果 CNTF和CNTFRα的免疫阳性反应产物在眼球和泪腺的组织定位基本相同, 包括角膜上皮细胞、固有层神经纤维、角膜细胞、内皮细胞, 虹膜上皮细胞, 睫状体上皮细胞, 晶状体上皮, 视网膜色素上皮细胞、苗勒细胞、节细胞层细胞, 球结膜上皮细胞, 泪腺腺细胞及导管上皮。结论 CNTF及其受体选择性地分布于眼球和泪腺的一些细胞中, 且多数细胞与房水和泪液的产生和接触有关。

电针对大鼠坐骨神经损伤后脊髓运动神经元睫状神经营养因子水平的影响

目的:探讨电针对大鼠坐骨神经损伤后脊髓运动神经元睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)的影响。方法:取Wistar大鼠56只,行左侧坐骨神经切断外膜缝合。电针组每天穴位电针20min,模型组不作任何处理。分别于术后7,14,21和28d测定脊髓前角CNTF阳性神经元计数、神经元平均积分光密度及4周时损伤神经电生理。结果:坐骨神经损伤后损伤脊髓前角CNTF阳性神经元数量明显少于正常对照组,电针组损伤侧脊髓前角内CNTF阳性神经元数量在各时间点明显高于模型组(P<0.05),14d时电针组伤侧脊髓前角内CNTF阳性神经元数量为(53±11)个,模型组为(29±9)个。同时模型组神经元内CNTF阳性神经元平均积分光密度在各时间点与正常组比较明显降低,在14d最低为273.2±33.7。而电针组CNTF在各个时间点明显高于模型组(P<0.05);28d康复组神经肌肉动作电位、运动神经传导速度均优于模型组(P<0.01)。结论:电针可提高损伤神经神经元内源性CNTF水平,减少神经元变性、死亡,促进神经电生理的恢复。

睫状神经营养因子对脊髓神经元的保护作用

目的 :研究脊髓损伤后脊髓神经元内酶学的变化 ,并探索睫状神经营养因子 (CNTF)对神经元的保护作用。 方法 :用 Allen改良法打击模型致 SD大鼠 T8脊髓损伤 ,分别于术前及术后 3,7,10 d测定脊髓组织内乙酰胆碱酯酶 (ACh E)和酸性磷酸酶 (ACP)的含量。结果 :ACh E于术后持续下降 ;ACP在术后第 3天开始上升 ,第 7天升至最高 ,以后逐渐下降 ;用 CNTF处理的大鼠上述两种酶变化的幅度较小 ,且整个过程也比较平稳。 结论

睫状神经营养因子突变体蛋白的活性研究

为了进一步研究应用计算机分子模拟设计并表达纯化的睫状神经营养因子突变体蛋白的生物学活性,分别采用鸡胚背根神经节无血清培养法、TF-1细胞增殖法、正常小鼠减重法对其活性进行研究。结果表明突变体蛋白能促进鸡胚背根神经节的生长;促进TF-1细胞增殖,MTT测定法表明突变体蛋白与国际参考品相比,比活不低于2.0×106U/mg;使正常小鼠的体重减轻,摄食量减少,脂肪指数下降,并且体重的减轻与突变体蛋白的给药剂量呈现良好的剂量依赖关系,其ED50为:150.986μg/(kg·d)。以上实验表明CNTF突变体蛋白具有促神经生长、促TF-1细胞增殖和减重的生物学活性,为其进一步的应用和开发提供了依据。

重组人睫状神经营养因子对糖尿病大鼠胃肠功能的影响

目的评价重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)对糖尿病大鼠胃肠道功能的作用。方法采用链脲佐菌素(strepto- zocin,STZ)诱发的糖尿病大鼠胃肠神经功能紊乱模型,肌注rhCNTF 0.1,0.3,0.9mg·kg^(-1),测定了rhCNTF对血糖、胃肠慢波电位、小肠壁内神经蛋白含量,观察了rhCNTF对胃肠推进功能的影响以及胃肠对乙酰胆碱(Ach)、阿托品敏感性的影响。结果肌内注射rhCNTF对血糖无明显影响,也未见rhCNTF改善十二指肠对Ach、阿托品的敏感性。肌注RhC- NTF可改善糖尿病大鼠胃肠慢波电位、提高了胃肠推进功能、增加了胃肠壁内神经蛋白含量。结论糖尿病导致的胃肠神经功能紊乱可以通过肌注rhCNTF而改善,其重要机制是rhCNTF对抗糖尿病引起的胃肠神经病变。

人睫状神经营养因子基因克隆、表达、纯化及其生物活性

［摘 要］目的 克隆人睫状神经营养因子（hCNTF）基因，在大肠杆菌宿主系统中高效表达并纯化，获得具有生物活性的hCNTF蛋白。方法 以人染色体DNA为模板，经PCR扩增到编码CNTF成熟蛋白的cDNA序列，并克隆进原核表达载体 pBV220，在大肠杆菌 BL21（Gold）中进行表达，产物经 CM-Sepharose FF柱纯化后，以体外培养的鸡胚背根神经节（DRG）测定生物活性。结果 重组表达质粒pBV22Z- CNTF在大肠杆菌BL21（Gold）中获得了非融合的稳定、高效表达，目的蛋白占细胞总蛋白的45％左右，以可溶性和包涵体两种形式存在，表达上清及包涵体复性后经CM柱一步纯化纯度达90％以上；表达的重组hCNTF能促进培养的鸡胚背根神经节神经突起的生长。结论 基因工程rhCNTF的获得为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定基础。

人血清白蛋白-睫状神经营养因子突变体融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化和活性鉴定

为了延长人睫状神经营养因子突变体的体内半衰期 ,将人血清白蛋白 (HSA)的C 末端和人睫状神经营养因子突变体AX15 (R13K)的N 末端通过一个 11个氨基酸的连接肽融合在一起 ,构建了融合蛋白HSA AX15 (R13K)。HSA AX15 (R13K)融合蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中进行表达后通过阳离子交换层析、反向层析和凝胶过滤对表达产物进行了分离纯化。体外TF 1细胞存活实验表明与HSA融合并未影响AX15 (R13K)的生物学活性。体内动物实验表明HSA AX15 (R13K)融合蛋白的疗效比AX15 (R13K)更为持久 :每 3天注射一次 4 8mg kg的HSA AX15 (R13K)融合蛋白的治疗效果优于每天注射一次 1 6mg kg的AX15 (R13K)的治疗效果。HSA AX15 (R13K)融合蛋白不但可以减少用药次数 ,提高病人的顺应性 ,而且还可以减少用药量和血药浓度的波动 ,从而降低副反应 ,在临床应用上具有一定的优势。

重组睫状神经营养因子对周围神经再生中多种细胞的作用

为了解重组睫状神经营养因子 ( CNTF)对周围神经再生中多种细胞的作用 ,用硅管套接切断的成年大鼠坐骨神经 ,在受损神经局部一次性给予重组睫状神经营养因子 :用免疫组织化学 ABC法结合计算机图像分析观测再生神经中 GAP-4 3、S10 0、CD68、MHC- 免疫反应阳性物质的变化。与生理盐水对照组相比 ,证明 CNTF组再生神经中上述四种物质显著增多。结果提示重组睫状神经营养因子能促进轴突的再生、Schwann细胞的迁入。

人睫状神经营养因子结构和功能的研究

目的：制备高活性的重组人睫状神经营养因子（ｈＣＮＴＦ），并研究其生物学功能。方法：应用大肠杆菌表达ｈＣＮＴＦ，用片段插入和缺失法研究其结构与功能关系；切断大鼠坐骨神经，局部及皮下给予ＣＮＴＦ，应用辣根过氧化物酶逆行追踪技术显示再生轴突通过修复部位的胞体。结果：ｈＣＮＴＦ分子中α－螺旋结构的维持对其生物活性十分重要，Ｃ端松散结构对其生物活性贡献不大，Ｄ螺旋中后段可能与生物活性有密切关系；与对照组相比，ＣＮＴＦ组脊髓标记胞体显著增加。结论：本研究为获得高活性、低副作用的ＣＮＴＦ提供了理论依据；所获ｈＣＮＴＦ能明显促进周围神经运动轴突的再生。

外源性重组人睫状神经营养因子抑制成人成肌细胞的体外分化

为探讨外源性重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)在成肌细胞分化中的作用,实验观察了0-10 ng/mlrhCNTF对成人成肌细胞体外分化的影响。结果表明,与对照组相比,2.5-10 ng/ml rhCNTF能显著抑制成肌细胞的体外分化(P<0.01),并呈量-效依赖关系,且这种抑制作用是可逆的。Western Blot分析提示,这种抑制作用伴有成肌细胞分化期特异标志myogenin和p21表达量的显著降低(P<0.01),以及成肌细胞增殖期特异标志myf5和desmin表达量的显著增加(P<0.01)。因此可以认为,外源性rhCNTF能可逆地抑制成人成肌细胞的体外分化并保持增殖。

慢性应激对大鼠海马神经元睫状神经营养因子及其mRNA表达水平的影响

目的 观察慢性应激对大鼠海马神经元CNTF及其mRNA表达水平的变化。方法 采用慢性不可预见性中等强度应激 ,运用旷场实验观察大鼠行为 ;运用免疫组化和原位杂交的方法 ,观察大鼠海马神经元CNTF及其mRNA表达水平的变化。结果 与对照组相比 ,慢性应激组大鼠海马CNTF免疫阳性颗粒数目减少 ,着色浅淡 ;CNTFmRNA杂交阳性信号减少。

乳糖诱导重组人睫状神经营养因子在大肠杆菌中的可溶性表达

目的利用乳糖替代IPTG,诱导重组人睫状神经营养因子(Recombinanthumanciliaryneurotrophicfactor,rhC-NTF)在原核工程菌BL-TCS中可溶性表达,并选择最适的诱导表达条件。方法在不同的温度下,利用不同浓度的乳糖及0·5mmol/L的IPTG,诱导含有人CNTF基因的工程菌9h,比较菌体生长、乳糖消耗以及目标蛋白的表达规律。结果乳糖组的菌体A600值均高于IPTG组。乳糖诱导产生的rhCNTF主要以可溶形式表达,各浓度乳糖的诱导效果均能接近或超过IPTG的效果。以2%乳糖在25℃下诱导6h,可以达到比较好的诱导效果。结论乳糖可取代IPTG诱导人CNTF基因表达,并获得良好效果。

睫状神经营养因子对大鼠去神经骨骼肌的营养作用

目的 :了解睫状神经营养因子 (CNTF)对去神经引起的肌肉萎缩的治疗作用。方法 :离断SD大鼠一侧坐骨神经 ,连续给予CNTF 2 0d ,观察肌肉湿重、蛋白含量、肌纤维横截面积、收缩性能和肢残程度。结果 :①给予 0 .2mg/kg的CNTF ,可使损伤侧肌纤维横截面积增加 35 % ,肌肉湿重增加 38% ,胫前肌总蛋白含量增加 2 4% ,腓长肌强直收缩强度提高 40 % ,显著改善肢残程度 ;② 0 .2mg/kg的CNTF作用明显强于 0 .0 5mg/kg的CNTF ;③比目鱼肌(慢肌 )比伸趾长肌 (快肌 )对CNTF更敏感。结论 :CNTF能显著改善成年大鼠坐骨神经离断后骨路肌的萎缩和功能丧失 。

睫状神经营养因子对严重烫伤大鼠纹状体及海马NOS阳性神经元的影响

目的：观察大鼠严重烫伤后纹状体和海马ＮＯＳ阳性神经元数目和阳性反应面积的变化及睫状神经营养因子（ＣＮＴＦ）对其的影响。方法：应用ＮＡＤＰＨ－ｄ酶组织化学的方法。结果：大鼠体表烫伤后３天，纹状体ＮＯＳ阳性神经元数目明显增加，染色呈强阳性，阳性反应面积增加。海马的ＮＯＳ阳性神经元数变化不明显，仅见阳性反应面积增加，睫状神经营养因子可降低纹状体的ＮＯＳ阳性神经元数目、阳性反应面积，ＮＯＳ阳性神经元着色较淡；海马的ＮＯＳ阳性反应面积也减少，睫状神经营养因子的作用与ＮＯＳ抑制剂Ｌ－ＮＡＭＥ的作用相似。结论；烫伤可引起大鼠脑内ＮＯＳ活性增加，睫状神经营养因子可能通过降低ＮＯＳ活性，从而减轻烫伤引起的神经元损伤。

视神经损伤时视网膜睫状神经营养因子受体的表达

目的研究睫状神经营养因子受体于视神经损伤后不同时间在视网膜中的表达情况,探讨外源性的睫状神经营养因子在神经损伤疾病中的应用价值。方法采用钳夹视神经的方法建立神经损伤的模型,在损伤后1、7、14、28d获取视网膜,提取总RNA及总蛋白,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定视网膜中睫状神经营养因子受体(CNTFR)αmRNA的表达,用WesternBlot方法了解损伤后不同时间CNTFRα蛋白水平的表达。结果在正常大鼠视网膜内CNTFRαmRNA无表达,在损伤后的1、7、14、28d均有一定水平的CNTFRαmRNA的表达,与正常对照比较差别具有显著性意义(P<0.01);损伤后备时间均有CNTFRα蛋白的表达,但CNTFRα蛋白的表达较弱。结论神经损伤后CNTF的表达先短暂升高以后持续下调,而CNTFRα-mRNA在损伤后4周内均有一定量的表达,提示补充外源性CNTF可能改善神经再生的微环境而发挥保护效应。

重组人睫状神经营养因子突变体的构建、表达及生物活性分析

目的:通过对原始CNTF的突变改造,降低表达蛋白的免疫原性,同时增加其稳定性,以期能用于临床治疗肥胖症。方法:以原始CNTF为模板,去掉N端的12个氨基酸、C端的14个氨基酸,并将C端末2个氨基酸点突变为极性较强的赖氨酸,在大肠杆菌中表达,获得CNTF-T突变体。结果:基因序列分析与原设计吻合,目的蛋白表达量占全菌体的35%左右,表达蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性、DEAE-FF纯化,纯度可达95%以上,小鼠体内生物活性测定,能明显抑制小鼠体重增长,且CNTF-T的生物活性比原始序列CNTF的活性高。结论:突变的CNTF-T有望成为新一代的生物减肥制剂应用于临床。

睫状神经营养因子对大鼠视神经损伤后视觉电生理的影响

目的 观察睫状神经生长因子 (ciliary neurotrophicfactor,CNTF)对视神经损伤后视觉电生理变化的作用 .方法 采用镊夹视神经法制作大鼠视神经损伤模型 ,夹伤后立即向球后一次性注射 CNTF5 0 ng,并于损伤当时和损伤后 1,2 ,3和 4wk时检测夹伤视神经眼的闪光视觉诱发电位 (flare-visional evoked potential,F- VEP) .结果 视神经夹伤后损伤眼 F- VEP的 P1波振幅 (wave am plitude,WA)在 1wk时下降 ,后回升 ;峰潜时 (wave latency,WL)延长 .CNTF组中WA在视神经夹伤后 1wk和 2 wk时与对照组相比差异显著(P<0 .0 5 ) ,WL仅在视神经夹伤后 1wk时与对照组相比具显著差异 (P<0 .0 5 ) .结论 视神经损伤后一次性球后注射CNTF在早期加强了神经系统对损伤的反应强度 ,促进了视神经损伤后神经冲动传导功能的恢复 .

神经生长因子与睫状神经营养因子促进大鼠坐骨神经再生的协同作用研究

目的:利用新型神经再生小室探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)促进周围神经再生的协同性作用。方法:36只大鼠随机分为A、B、C3组,每组12只,用自行研制的梭形双通道桥接管桥接坐骨神经10mm缺损。A组,2支管内均注入几丁糖凝胶(100μl);B组,一侧支管内注入几丁糖(100μl)+NGF(5μl)+生理盐水(5μl),另一侧支管内注入几丁糖(100μl)+NGF(5μl)+CNTF(5μl);C组,一侧支管内注入几丁糖(100μl)+CNTF(5μl)+生理盐水(5μl),另一侧支管内注入几丁糖(100μl)+NGF(5μl)+CNTF(5μl)。术后8、16周对再生神经的大体形态、常规病理及超微结构进行观察,并用核黄逆行示踪评估再生神经的轴浆运输功能。结果:NGF+CNTF侧再生神经呈淡黄色,质韧,弹性佳,优于对照侧,形态学观察见再生神经纤维数目多,粗细均匀,排列整齐,有髓纤维髓鞘厚,轴突直径大。其轴浆运输功能也明显优于对照侧。结论:NGF与CNTF对促进周围神经形态结构和功能的恢复均具有明显的协同作用。