人骨髓间充质干细胞的体外培养及睫状神经节神经营养因子诱导其向神经元样细胞分化的研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(h-MSCs)体外培养条件及睫状神经节神经营养因子(CNTF)对h-MSCs向神经元样细胞分化的影响。方法采用梯度离心法和全骨髓法相结合,利用含血清的DMEM/F12培养基培养h-MSCs,以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24h后再以不同浓度CNTF诱导,传至第3代时h-MSCs开始向神经元样细胞方向分化。应用免疫细胞化学技术对培养细胞及其分化细胞进行鉴定。结果h-MSCs在体外培养条件下能保持旺盛的增殖能力,CNTF诱导后细胞形态发生明显改变,伸出突起,类似神经元;免疫细胞化学法检测显示CD44、CD54以及诱导后神经元特异性蛋白(NSE)和巢蛋白(nestin)均呈阳性表达。10ng/mL实验组NSE阳性细胞占细胞总数的(42.42±1.39)%,nestin阳性细胞占细胞总数的(45.36±1.60)%。结论h-MSCs可在体外扩增、培养。h-MSCs经bFGF预诱导后再经CNTF诱导可向神经元样细胞方向分化。10ng/mL为CNTF的最适诱导浓度。

睫状神经节神经营养因子在大鼠坐骨神经生后发育中的表达──免疫组织化学研究

用免疫组织化学ＡＢＣ技术和计算机图像处理系统研究了ｌｄ龄、１月龄、２月龄和３月龄大鼠坐骨神经中睫状神经节神经营养因子样免疫反应的分布及其强度的变化。结果表明，在４个年龄组中均存在阳性免疫反应。阳性免疫反应见于雪旺细胞胞浆；轴突和髓鞘呈阴性。睫状神经节神经营养因子免疫反应以１月龄鼠最高，２月龄次之，３月龄最低。本文的结果提示，睫状神经节神经营养因子在出生后即存在于雪旺细胞中，其含量随周围神经的发育而有所变化。

睫状神经节神经营养因子基因克隆

在构建了再生性外周神经组织cDNA文库的基础上，人工合成了睫状神经节神经营养因子（CNTF）阅读框架的引物，用PCR地高辛标记法标记了CNTF探针．筛选CDNA文库，得到了CNTF的阳性克隆，运用PCR法证实了克隆中存在着全长CNTF阅读框架，Sanger法测定了DNA序列，证实序列无误。CNTF基因克隆为从基因水平上研究CNTF的分子生物学作用机制打下基础．

新型纳米睫状神经营养因子复合物玻璃体腔注射对食蟹猴眼部的安全性——形态学评价

目的评估一种新型纳米神经营养因子复合物(NP-CNTFs)在非人灵长类动物眼内应用的安全性。方法利用纳米工艺制备包裹睫状神经营养因子(CNTF)的纳米粒。选取3只成年雄性食蟹猴,单眼玻璃体腔注射10μl NP-CNTFs(1μg/μl)作为NP-CNTFs组,对侧眼注射等体积磷酸盐缓冲液作为对照组。在注射前、注射后第3天和第7天,对食蟹猴行常规眼前节检查以评估结膜充血、前房闪辉及前房细胞等眼部症状并评分;采用彩色眼底照相观察眼底情况;采用频域光学相干断层扫描(SD-OCT)检测视网膜形态结构及厚度。结果所制备NP-CNTFs粒径为(317±3)nm,多分散性指数为0.042±0.015,Zeta电位为(-38.9±0.7)mV,具备较好的稳定性、生物利用度和生物相容性。眼前节检查显示,NP-CNTFs组在注射后第3天表现出较对照组稍明显的结膜充血、前房闪辉和前房细胞,但在注射后第7天基本恢复正常。NP-CNTFs组与对照组注射后第3天眼前节症状评分分别为(2.67±0.88)和(1.00±0.58)分,注射后第7天分别为(0.67±0.33)和(0.33±0.33)分,组间比较差异均无统计学意义(t=2.50、1.00,均P>0.05)。彩色眼底照相结果显示,NP-CNTFs组和对照组在注射后第7天眼底均正常,未见玻璃体混浊、玻璃体出血、视网膜出血或视盘水肿等异常改变。SD-OCT结果显示,NP-CNTFs组和对照组在注射后第7天均未见明显视网膜组织学改变。NP-CNTFs组和对照组视网膜神经纤维层厚度分别为(107.67±0.88)和(111.00±3.22)μm,黄斑中央凹厚度分别为(255.67±2.03)和(254.67±3.84)μm,组间比较差异均无统计学意义(t=1.43、0.50,均P>0.05)。结论新型纳米药物NP-CTNFs在食蟹猴眼内应用的安全性较好。

依托咪酯对视神经损伤成年大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、脑源性神经营养因子蛋白表达的影响

目的:探讨依托咪酯对视神经损伤成年大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白表达的影响。方法:选择成年雄性SD大鼠40只,随机选8只为正常照组,其余32只采用动脉夹夹持法损伤视神经建立视神经损伤模型并分组,即模型组(视神经损伤大鼠),依托咪酯低、中、高剂量组(依托咪酯腹腔注射),剂量分别为2、4、6 mg/kg。分析比较干预后各组大鼠眼压变化。并行HE染色观察视网膜组织结构,比较各组大鼠视网膜神经节细胞(RCGs)存活数目及存活率,Western blot法检测视网膜组织中Caspase-3、BDNF蛋白表达。结果:模型组、依托咪酯各组眼压高于正常组,依托咪酯各组末次给药后眼压降低,且呈剂量依赖性(均P<0.05)。模型组大鼠视网膜水肿增厚,以神经纤维层最为明显,且有空泡,RGC细胞肿胀,内、外核层细胞数量减少,排列紊乱。依托咪酯各组视网膜病理损伤均有改善,高剂量组好于中剂量组,中剂量组好于低剂量组。与正常组比较,模型组大鼠RCGs存活数目减少(P<0.05),与模型组比较,依托咪酯各组RCGs存活数目增多(P<0.05)。依托咪酯高剂量组RCGs存活数目、相对存活率高于中、低剂量组(均P<0.05)。正常组大鼠视网膜组织中BDNF蛋白表达高于模型组,Caspase-3低于模型组,依托咪酯各组视网膜组织中BDNF升高,Caspase-3下降,均呈剂量依赖性(均P<0.05)。结论:Caspase-3蛋白在大鼠视神经损伤中表达升高,BDNF蛋白表达降低,依托咪酯干预能够促进视网膜RGCs存活,对视神经损伤具有保护作用。

复方脑肽节苷脂联合依达拉奉右莰醇对急性脑梗死患者炎症因子及神经营养因子的影响

目的:探讨复方脑肽节苷脂联合依达拉奉右莰醇治疗对急性脑梗死(ACI)患者经炎症因子及神经营养因子的影响.方法:选取2022年1月至2023年9月本院收治的89例ACI患者作为研究对象.依据治疗方法,将其分为观察组(n=47,给予复方脑肽节苷脂联合依达拉奉右莰醇治疗)和对照组(n=42,仅给予依达拉奉右莰醇治疗),两组均连续治疗14d.比较两组患者治疗前及治疗14d时炎症因子指标、神经营养因子指标及治疗期间不良反应发生率.结果:治疗后,观察组患者血清白细胞介素(IL)-6、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子(TNF)-ɑ水平低于对照组,脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);两组患者不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论:复方脑肽节苷脂联合依达拉奉右莰醇治疗ACI能够缓解患者炎症反应,保护脑神经,且安全性良好.

睫状神经营养因子对大鼠急性高眼压眼视网膜神经节细胞的保护作用

背景青光眼可以引起视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡，据报道睫状神经营养因子（CNTF）对外伤性视神经损伤有修复作用，其是否对青光眼视神经病变有保护作用尚少见报道。目的观察CNTF对大鼠急性高眼压眼RGCs的保护作用。方法24只Wistar大鼠双眼采用眼前房平衡盐液加压灌注法建立大鼠急性高眼压模型，造模前2d左眼玻璃体内注入0．5DgCNTF5斗l，右眼以同样的方法注射磷酸钠溶液5¨l，另取3只正常大鼠作为正常对照。造模后1、3、7、14d过量麻醉法处死动物并摘除眼球，制备视网膜组织学切片后采用苏木精一伊红染色法进行形态学观察，光学显微镜下计数RGCs数目；采用免疫组织化学染色法观察RGCs层谷氨酸的表达情况。结果正常对照组大鼠视网膜各层排列整齐，细胞边界清晰；模型对照组大鼠RGCs细胞膜、细胞核均发现异常改变，有细胞空泡样变；CNTF治疗组大鼠造模后变性的RGCs数量少。与模型对照组比较，造模后3、7、14dCNTF治疗组RGCs数目明显增加，差异均有统计学意义（均P=0．000）。免疫组织化学染色表明，造模后3～7d，CNTF治疗组RGCs层谷氨酸阳性细胞数分别为（5．50±1．04）个／3个高倍视野和（6．00±1．41）个／3个高倍视野，明显低于模型对照组的（9．00＋2．91）个／3个高倍视野和（10．834-1．94）个／3个高倍视野，差异均有统计学意义（均P=0．000），而造模后1d和14d两组间谷氨酸阳性细胞数的差异均无统计学意义（P=0．578、0．180）。结论CNTF能够下调急性高眼压眼谷氨酸在RGCs中的表达。

睫状神经营养因子对纯化培养大鼠视网膜神经节细胞突起再生的影响

目的观察睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）对纯化培养大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）突起再生的影响。方法取新生SD大鼠视网膜，消化并利用筛网纯化后接种于96孔板，加入不同浓度（10μg·L-1、20μg·L-1、30μg·L-1、40μg·L-1）CNTF作为实验组，不加CNTF作为对照。根据细胞形态及免疫细胞化学的方法鉴定细胞，观察RGCs生长规律，观测随机选取视野下的RGCs数和有突起细胞数（400倍荧光显微镜和相差显微镜）。结果 纯化的RGCs在含体积分数20％胎牛血清DMEM培养液中可存活30d。加入CNTF后3~5d，40μg·L-1组突起率显著高于对照组（P〈0.05）。7~15d，20μg·L-1、30μg·L-1、40μg·L-1组突起率显著高于时照组（P〈0.05），30μg·L-1、40μg·L-1组突起率显著高于10μg·L-1、20μg·L-1组（P〈0.05）。结论CNTF能显著促进RGCs突起再生，CNTF的浓度和突起率存在量效关系，一定浓度范围内．高浓度CNTF可较早促进突起再生。

睫状神经营养因子对培养大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响

目的 :观察睫状神经营养因子 (CNTF)对培养大鼠视网膜神经节细胞 (RGCs)凋亡的影响。方法 :15只生后 2～ 3dWistar大鼠 ,视网膜采用胰酶消化法制成细胞悬液后接种于 2 4孔培养板 (每孔 1× 10 5个细胞 ) ,取培养 72h的细胞行免疫细胞化学鉴定。将培养的细胞随机分为对照组、三种浓度CNTF组 (10ng/ml、2 0ng/ml、4 0ng/ml) ,培养 72h后采用TUNEL法和流式细胞仪检测培养大鼠视网膜神经节细胞凋亡的变化。结果 :培养 72h的细胞 90 %以上为视网膜神经节细胞 ,TUNEL法检测显示培养细胞有凋亡细胞存在 ,流式细胞仪检测结果显示对照组凋亡率为 (11.95± 4 .4 0 0 ) % ,10ng/ml、2 0ng/ml、4 0ng/mlCNTF组凋亡率分别为(7.883± 2 .14 6 ) % ,(6 .4 17± 3.317) % ,(8.0 33± 2 .0 2 3) % ,CNTF组凋亡率显著降低 (P <0 .0 1～ 0 .0 5 ) ,其中2 0ng/mlCNTF组差异非常显著 (P <0 .0 1)。结论 :CNTF能降低培养大鼠视网膜神经节细胞凋亡率 ,其促视网膜神经节细胞存活可能是通过减少视网膜神经节细胞凋亡来起作用 ,而高浓度CNTF对视网膜神经节细胞有毒副作用。

睫状神经营养因子对视网膜神经节细胞的保护作用

视网膜神经节细胞(RGC)是唯一能通过轴突传递视觉信号到中枢神经系统的神经细胞。各种视网膜退行性病变、外伤时,RGC受损造成视力毁灭性丧失。睫状神经营养因子(CNTF)是研究最多的有关视网膜退行性病变的神经营养因子之一。其能刺激细胞生长和神经干细胞的分化,并有神经保护和促进神经轴突再生的作用。除玻璃体腔直接注射CNTF外,目前广泛使用的还有病毒转染的给药方式,对青光眼、视神经损伤、视网膜色素变性等模型中RGC有保护作用以及促进轴突再生。

免疫酶双重染色法显示再生神经中的神经生长因子与睫状节神经营养因子

本研究以成人正中神经切割伤后２～３个月的神经干为材料，冰冻切片，用免疫双重染色技术显示了神经生长因子与睫状节神经营养（诱向）因子在再生的周围神经组织中的表达与分布。神经生长因子选用ＡＰＡＡＰ法．其阳性产物呈红色；睫状节神经营养（诱向）因子选用ＡＢＣ系统，４氯－１－萘酚显色，阳性产物为褐色。光镜下观察：神经生长因子的阳性反应产物出现在正中神经切割伤后再生的神经纤维中，高倍镜下可见其阳性产物分布在轴索，而在雪旺氏细胞中没能见到呈红色的阳性反应产物；睫状节神经营养（诱向）因子分布在一些细胞体积大、核大呈增生活跃状态的雪旺氏细胞中。红与褐双色反应产物色调清晰，效果较好。研究结果提示：睫状节神经营养（诱向）因子与神经生长因子在人周围神经再生过程中起着十分重要的作用。

睫状神经营养因子与视网膜神经节细胞

睫状神经营养因子作为神经营养因子家族中的重要成员,广泛分布于中枢神经系统。视神经与视网膜是中枢神经系统的一部分。视网膜神经节细胞在视觉通路中起着重要的传导作用。睫状神经营养因子作为一种非靶源性神经营养因子,在视网膜神经节细胞的生长发育过程中,起着重要的调控作用;同时睫状神经营养因子对于损伤的视网膜神经节细胞有促进其存活及轴突再生的作用。

睫状神经营养因子调节受损视神经胶质细胞去分化相关基因的表达

目的探讨睫状神经营养因子(CNTF)对受损视神经胶质细胞去分化的作用及机制。方法将65只SD大鼠随机分为对照组、损伤组和CNTF组,制备视神经损伤及损伤后添加CNTF的动物模型。术后7、14 d取术侧视神经损伤远侧段,分别用基因芯片检测其基因表达谱,实时荧光定量PCR、免疫组织化学、HE染色等方法检测相关基因、蛋白表达和细胞数量的变化。结果术后7 d,与损伤组相比,CNTF组筛选出608条表达上调和417条表达下调的差异基因,包括染色质构型、转录调节、神经干细胞、神经分化和发育、增殖凋亡、离子通道、受体、信号转导等相关基因。实时荧光定量PCR结果验证了基因芯片结果的可靠性。CNTF组视神经损伤远侧段细胞数量增多,远侧段Nestin、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、细胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2)和近侧段神经丝(NF)阳性物质增多。结论外源性CNTF通过调节受损视神经大胶质细胞的去分化相关基因及蛋白的表达,促进了胶质细胞的去分化和轴突再生。

睫状神经营养因子对大鼠视神经损伤后视网膜神经节细胞的保护作用

目的:探讨玻璃体腔内注射外源性睫状神经营养因子(CNTF)是否对大鼠视神经中度不全损伤视网膜神经节细胞(RGCs)具有保护作用。方法:采用无创血管钳对成年大鼠造成视神经中度不全损伤,实验组伤后即时1、2、4周分别向玻璃体腔内注射CNTF溶液2μl;同实验组操作,对照组在每个时间点向玻璃体腔内注射2μl双蒸水。在伤后1、2、4、8周时分别做生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)免疫组织化学检测和光镜的组织学观察。结果:①伤后1周对照组和实验组视网膜均有水肿,RGCs肿胀。伤后2周2组视网膜神经节细胞层(GCL)均变稀疏,实验组水肿明显减轻。伤后4周水肿消退,GCL层细胞数明显下降。8周实验组视网膜厚度正常,对照组各层变薄。②伤后1周对照组和实验组GAP-43在GCL层表达呈阳性。伤后2、4、8周GAP-43在GCL层表达至高峰。实验组明显强于对照组(P<0.01)。结论:CNTF对大鼠视神经损伤后RGCs具有明显的保护作用。

缓释神经营养因子3和神经节苷脂GD1a的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球修复大鼠脊髓损伤

背景:非侵入式脊髓损伤治疗方法亟待开发。纳米材料能够递送药物,提高治疗效果,具有明显优势。目的:制备缓释神经营养因子3和神经节苷脂GD1a的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球,探究其对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法:采用油水乳液挥发有机溶剂法,制备缓释神经营养因子3的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球和缓释神经节苷脂GD1a的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球,检测微球的缓释性能。采用随机数字表法将60只雌性SD成年大鼠分为5组:假手术组打开椎板后直接缝合,脊髓损伤组建立脊髓T9撞击损伤模型,神经营养因子组脊髓T9损伤区域注射缓释神经营养因子3的纳米微球悬液,神经节苷脂组脊髓T9损伤区域注射缓释经节苷脂GD1a的纳米微球悬液,实验组脊髓T9损伤区域注射缓释神经营养因子3的纳米微球和缓释神经节苷脂GD1a的纳米微球混合悬液,每组12只。术后每周进行旷场实验及BBB评分,术后4,8周进行脊髓组织形态学观察。结果与结论:(1)体外浸泡于PBS 14 d内,缓释纳米微球可持续释放神经营养因子3和神经节苷脂GD1a。(2)术后7,8周,与脊髓损伤组比较,神经营养因子组、实验组大鼠的BBB评分、旷场总移动距离增加(P<0.05)。尼氏染色显示,实验组术后4,8周的脊髓灰质前角运动神经元多于脊髓损伤组(P<0.05),神经营养因子组术后8周的脊髓灰质前角运动神经元多于脊髓损伤组(P<0.05)。免疫荧光染色显示,与脊髓损伤组比较,神经营养因子组术后8周、实验组术后4,8周的脊髓白质腹侧神经纤维增多(P<0.05),神经节苷脂组、实验组术后4,8周的脊髓白质腹侧髓鞘碱性蛋白表达增加(P<0.05),神经营养因子组术后8周的髓鞘碱性蛋白表达增加(P<0.05),神经营养因子组、实验组术后8周的下行脊髓固有束增加(P<0.05)。(3)结果表明,神经营养因子3微球单独应用,或是与神经节苷脂GD1a微球联合应用,能够促进脊髓损伤区周边运动神经元及神经纤维存活,并可改善大鼠后肢运动功能。

睫状节神经营养因子在大鼠损伤坐骨神经中的表达变化

目的 :探索坐骨神经损伤后睫状节神经营养因子 CNTF的表达变化。方法 :采用抗 CNTF抗体以Western Blot方法检测大鼠损伤两周坐骨神经远侧端和正常神经中 CNTF表达。结果 :正常神经组织中在 2 2 k D处有特异性 CNTF阳性反应条带 ,在损伤两周的坐骨神经远侧端中尚未出现 CNTF阳性反应条带。结论 :正常成年鼠坐骨神经中 CNTF表达处于一定的水平 ,神经损伤两周后的坐骨神经远侧端中 CNTF表达明显减少。

载睫状神经营养因子聚乙二醇-乳酸/羟基乙酸共聚物微泡联合超声对视网膜神经节细胞的保护作用

目的制备载睫状神经营养因子(CNTF)的聚乙二醇(PEG)-乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)超声微泡造影剂(CNTF-PEG-PLGA),观察其联合超声对视神经损伤大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)的保护作用。方法采用双乳化法制备CNTF-PEG-PLGA,并检测其基本特性。随机选取SD大鼠145只(双眼兼用),将其分为7组,采用视神经钳夹法制作大鼠视神经损伤模型。治疗后应用荧光金(FG)逆行标记法比较各组大鼠RGCs存活数;视网膜组织病理切片观察视网膜的形态结构改变,评价载药微泡及联合超声的安全性;生长相关蛋白-43(GAP-43)免疫组化染色,观察大鼠视网膜GAP-43的表达情况。结果CNTF-PEG-PLGA微泡平均粒径(312.5±57.35)nm,包封率62.35%,载药量0.298μg/mg,体外释放28天时微泡释放率达93.60%。FG标记RGCs示,在每个观察时间点G组平均RGCs计数均显著高于其他各损伤组(P<0.05),但仍低于A组(P<0.05);G组GAP-43表达可持续到伤后4周,且明显高于其他各组(P<0.05);视网膜组织病理切片示玻璃体腔注射微泡后视网膜未见明显炎性细胞浸润现象。结论载睫状神经营养因子PEG-PLGA微泡联合超声可增强药物对视神经损伤大鼠视网膜神经节细胞的保护作用,延长药物作用时间。

电针对大鼠坐骨神经损伤后脊髓运动神经元睫状神经营养因子水平的影响

目的:探讨电针对大鼠坐骨神经损伤后脊髓运动神经元睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)的影响。方法:取Wistar大鼠56只,行左侧坐骨神经切断外膜缝合。电针组每天穴位电针20min,模型组不作任何处理。分别于术后7,14,21和28d测定脊髓前角CNTF阳性神经元计数、神经元平均积分光密度及4周时损伤神经电生理。结果:坐骨神经损伤后损伤脊髓前角CNTF阳性神经元数量明显少于正常对照组,电针组损伤侧脊髓前角内CNTF阳性神经元数量在各时间点明显高于模型组(P<0.05),14d时电针组伤侧脊髓前角内CNTF阳性神经元数量为(53±11)个,模型组为(29±9)个。同时模型组神经元内CNTF阳性神经元平均积分光密度在各时间点与正常组比较明显降低,在14d最低为273.2±33.7。而电针组CNTF在各个时间点明显高于模型组(P<0.05);28d康复组神经肌肉动作电位、运动神经传导速度均优于模型组(P<0.01)。结论:电针可提高损伤神经神经元内源性CNTF水平,减少神经元变性、死亡,促进神经电生理的恢复。

睫状神经营养因子对脊髓神经元的保护作用

目的 :研究脊髓损伤后脊髓神经元内酶学的变化 ,并探索睫状神经营养因子 (CNTF)对神经元的保护作用。 方法 :用 Allen改良法打击模型致 SD大鼠 T8脊髓损伤 ,分别于术前及术后 3,7,10 d测定脊髓组织内乙酰胆碱酯酶 (ACh E)和酸性磷酸酶 (ACP)的含量。结果 :ACh E于术后持续下降 ;ACP在术后第 3天开始上升 ,第 7天升至最高 ,以后逐渐下降 ;用 CNTF处理的大鼠上述两种酶变化的幅度较小 ,且整个过程也比较平稳。 结论