睫状神经营养因子突变体的设计及活性分析

利用计算机分子模拟系统模建了CNTFRα的三维结构,并对CNTF与CNTFRα结合的关键部位进行分析,同时综合了同源比较的结果及CNTF分子自身的特点,设计了2个CNTF的突变体A和B.表达纯化后得到目的蛋白,TF-1细胞增殖实验的结果表明,2个突变体蛋白的比活性均达到106U/mg的水平,且A的活性大于B的活性.上述结果初步表明设计的合理性,为其进一步的开发和应用奠定了基础.

重组人睫状神经营养因子突变体对小鼠代谢综合征的作用研究

目的：在2型糖尿病的早期，胰岛素抵抗是一系列潜在的心血管疾病高危因素的协同因素，这一系列代谢性疾病通常称为代谢综合征。该综合征最初以胰岛素抵抗作为主要的代谢性缺陷并伴发一些疾病，如高血压、高脂血症和中心性肥胖症。随着时间延长，该综合征的组成成份继续增加，最终促进了动脉粥样硬化性心血管病和2型糖尿病的发生。

睫状神经营养因子突变体蛋白的活性研究

为了进一步研究应用计算机分子模拟设计并表达纯化的睫状神经营养因子突变体蛋白的生物学活性,分别采用鸡胚背根神经节无血清培养法、TF-1细胞增殖法、正常小鼠减重法对其活性进行研究。结果表明突变体蛋白能促进鸡胚背根神经节的生长;促进TF-1细胞增殖,MTT测定法表明突变体蛋白与国际参考品相比,比活不低于2.0×106U/mg;使正常小鼠的体重减轻,摄食量减少,脂肪指数下降,并且体重的减轻与突变体蛋白的给药剂量呈现良好的剂量依赖关系,其ED50为:150.986μg/(kg·d)。以上实验表明CNTF突变体蛋白具有促神经生长、促TF-1细胞增殖和减重的生物学活性,为其进一步的应用和开发提供了依据。

重组人睫状神经营养因子突变体的构建、表达及生物活性分析

目的:通过对原始CNTF的突变改造,降低表达蛋白的免疫原性,同时增加其稳定性,以期能用于临床治疗肥胖症。方法:以原始CNTF为模板,去掉N端的12个氨基酸、C端的14个氨基酸,并将C端末2个氨基酸点突变为极性较强的赖氨酸,在大肠杆菌中表达,获得CNTF-T突变体。结果:基因序列分析与原设计吻合,目的蛋白表达量占全菌体的35%左右,表达蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性、DEAE-FF纯化,纯度可达95%以上,小鼠体内生物活性测定,能明显抑制小鼠体重增长,且CNTF-T的生物活性比原始序列CNTF的活性高。结论:突变的CNTF-T有望成为新一代的生物减肥制剂应用于临床。

人血清白蛋白-睫状神经营养因子突变体融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化和活性鉴定

为了延长人睫状神经营养因子突变体的体内半衰期 ,将人血清白蛋白 (HSA)的C 末端和人睫状神经营养因子突变体AX15 (R13K)的N 末端通过一个 11个氨基酸的连接肽融合在一起 ,构建了融合蛋白HSA AX15 (R13K)。HSA AX15 (R13K)融合蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中进行表达后通过阳离子交换层析、反向层析和凝胶过滤对表达产物进行了分离纯化。体外TF 1细胞存活实验表明与HSA融合并未影响AX15 (R13K)的生物学活性。体内动物实验表明HSA AX15 (R13K)融合蛋白的疗效比AX15 (R13K)更为持久 :每 3天注射一次 4 8mg kg的HSA AX15 (R13K)融合蛋白的治疗效果优于每天注射一次 1 6mg kg的AX15 (R13K)的治疗效果。HSA AX15 (R13K)融合蛋白不但可以减少用药次数 ,提高病人的顺应性 ,而且还可以减少用药量和血药浓度的波动 ,从而降低副反应 ,在临床应用上具有一定的优势。

睫状神经营养因子突变体的克隆、表达、纯化及生物学活性

目的设计具有更高生物学活性的睫状神经营养因子突变体,并对其进行表达、纯化及生物学活性检测。方法以计算机分子模拟系统设计突变体,重叠延伸PCR方法获得突变体的编码区DNA序列,克隆入表达载体pThioHisA,转化E.coliBL21,以IPTG诱导表达。复性纯化后,用鸡胚背根神经节无血清培养法和小鼠减重法进行生物学活性测定。结果目的蛋白以包涵体形式存在,表达量在35%以上,纯化后的纯度达95%以上,能有效地促进鸡胚背根神经节的生长,并能使正常小鼠的体重降低,脂肪指数下降。结论所设计的突变体经表达及纯化后,具有良好的生物学活性,为进一步研究突变体蛋白的促神经生长和减肥作用奠定了基础。

蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体基因的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

AX15是一种比天然睫状神经营养因子具有更高的生物学活性、更好的稳定性和可溶性的hCNTF突变体。在巴斯德毕赤酵母中表达时AX15易发生降解。氨基酸序列分析表明降解位于由 12和 13位氨基酸残基组成的双碱性氨基酸之后。根据KEX2蛋白酶的底物专一性把双碱性氨基酸从RR变为RK ,构建了KEX2抗性的AX15突变体AX15 (R13K)。AX15 (R13K)的稳定性得到了显著的提高 ,在诱导 10 0h后也未发生降解。利用超滤浓缩和凝胶过滤得到了纯度 >90 %的AX15 (R13K)。TF 1细胞存活实验表明AX15 (R13K)具有与AX15相同的生物学活性。蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体可能具有更好的体内稳定性 ,在临床应用上具有潜在的优势。

高比活人睫状神经营养因子突变体基因的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

人睫状神经营养因子(hCNTF)及其突变体有望成为治疗肥胖症的新型药物。为了减少hCNTF的副反应,提高其疗效,在hCNTF四重突变体AX15 (R13K)的基础上引入S16 5D Q16 6H突变,构建了高比活的DH_AX15 (R13K)突变体。体外和体内实验表明DH_AX15 (R13K)的活性约是AX15 (R13K)的5倍。同时体内实验还发现DH_AX15(R13K)的作用比AX15 (R13K)更为持久。这种更为持久的作用可能是由于活性提高而非半衰期延长引起的。高比活的hCNTF突变体一方面可以在保证疗效的前提下减少蛋白用量,减少副反应;另一方面可以在不增加副反应的前提下增加最大耐受剂量,提高疗效。

睫状神经营养因子突变体的中试工艺研究

目的进行睫状神经营养因子及其突变体的应用开发,研究其中试生产工艺。方法摸索了不同的发酵条件以确定最佳的发酵工艺,采用稀释复性-离子交换色谱-分子筛相结合的方法对其进行复性和纯化。结果得到的蛋白经HPLC检测纯度在95%以上,比活性的达到2.0×106U/mg,末端的15个氨基酸序列和Western blot的结果与要求相符。结论中试工艺简单、迅速,所需设备廉价,有利于大规模生产。

重组人睫状神经营养因子突变体的制备及PEG修饰

通过大肠杆菌重组表达人睫状神经营养因子突变体(CNTFm),并进行PEG修饰,旨在降低免疫原性。该突变体将天然CNTF的C端15个氨基酸删除,大肠杆菌表达的CNTFm以包含体形式存在,经复性、纯化获得纯度达到95%的目的蛋白。体内生物学活性测定结果显示,给药10d,小鼠最大体重减少率达31%,产生的最高中和抗体滴度达到1∶6400;经PEG修饰,CNTF突变体的生物学活性降低了34%,但最高中和抗体滴度降低到1∶800。该PEG修饰后的CNTFm制备工艺有望为CNTF的临床应用开辟道路。

新型纳米睫状神经营养因子复合物玻璃体腔注射对食蟹猴眼部的安全性——形态学评价

目的评估一种新型纳米神经营养因子复合物(NP-CNTFs)在非人灵长类动物眼内应用的安全性。方法利用纳米工艺制备包裹睫状神经营养因子(CNTF)的纳米粒。选取3只成年雄性食蟹猴,单眼玻璃体腔注射10μl NP-CNTFs(1μg/μl)作为NP-CNTFs组,对侧眼注射等体积磷酸盐缓冲液作为对照组。在注射前、注射后第3天和第7天,对食蟹猴行常规眼前节检查以评估结膜充血、前房闪辉及前房细胞等眼部症状并评分;采用彩色眼底照相观察眼底情况;采用频域光学相干断层扫描(SD-OCT)检测视网膜形态结构及厚度。结果所制备NP-CNTFs粒径为(317±3)nm,多分散性指数为0.042±0.015,Zeta电位为(-38.9±0.7)mV,具备较好的稳定性、生物利用度和生物相容性。眼前节检查显示,NP-CNTFs组在注射后第3天表现出较对照组稍明显的结膜充血、前房闪辉和前房细胞,但在注射后第7天基本恢复正常。NP-CNTFs组与对照组注射后第3天眼前节症状评分分别为(2.67±0.88)和(1.00±0.58)分,注射后第7天分别为(0.67±0.33)和(0.33±0.33)分,组间比较差异均无统计学意义(t=2.50、1.00,均P>0.05)。彩色眼底照相结果显示,NP-CNTFs组和对照组在注射后第7天眼底均正常,未见玻璃体混浊、玻璃体出血、视网膜出血或视盘水肿等异常改变。SD-OCT结果显示,NP-CNTFs组和对照组在注射后第7天均未见明显视网膜组织学改变。NP-CNTFs组和对照组视网膜神经纤维层厚度分别为(107.67±0.88)和(111.00±3.22)μm,黄斑中央凹厚度分别为(255.67±2.03)和(254.67±3.84)μm,组间比较差异均无统计学意义(t=1.43、0.50,均P>0.05)。结论新型纳米药物NP-CTNFs在食蟹猴眼内应用的安全性较好。

一种重组人睫状神经营养因子突变体的分离纯化及结构鉴定

研究并建立从细胞破碎上清中获得一种含游离半胱氨酸的重组人睫状神经营养因子突变体(CNTF-C17)的分离纯化方法并对纯化产物的结构及活性进行表征。通过疏水层析、离子交换和亲和层析的组合层析路线,能实现目标蛋白与其它杂蛋白的有效分离。组合层析后CNTF-C17的纯化倍数可达11.4,收率35.5%。反相高效液相色谱和凝胶过滤层析证明产物纯度可达到98%以上,且以单体形式稳定存在,无分子间二硫键结合的二聚体。质谱测得产物分子量与理论值一致,圆二色光谱和荧光光谱证明纯化产物具有正确的二、三级结构,TF-1.CN5a.1细胞增殖活性检测表明纯化产物比活达到2.1×106IU/mg。因此,为这种新的CNTF突变体规模化生产及后续应用奠定了基础。

重组人睫状神经营养因子突变体及其聚乙二醇修饰物的制备及其对ob/ob肥胖小鼠体重、糖脂代谢的影响

目的 制备重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rhCNTF)突变体[rhCNTF(R^6315)]及其聚乙二醇修饰物[P-rhCNTF(R^6315)],探讨两者对ob/ob肥胖小鼠体重及糖脂代谢的影响。方法 采用rhCNTF(R^6315)突变体工程菌株E.coli BL21(DE3)表达rhCNTF(R^6315),经硫酸铵沉淀、Butyl HP和Q HP纯化后采用PEG修饰剂Y-40KD-MAL-mPEG对其C17游离巯基进行定点修饰,经QH P层析纯化获得P-rhCNTF(R^6315)。上述产物进行SDS-PAGE、纯度、修饰率、二级结构表征、修饰位点、体外活性、体内药代动力学检测。将ob/ob小鼠分为P-rhCNTF(R^6315)组(0.05、0.1、0.2 mg/kg)、rhCNTF(R^6315)组及赋形剂组,均采用高脂饲料喂养,同时设C57BL/6J组(普通饲料喂养C57BL/6J小鼠),检测各组小鼠的体重、摄食量及糖脂代谢情况。结果 rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315)纯度分别为97.4%和99.3%,平均比活分别为9. 5×10^5和6. 9×10^5 IU/mg,相对比活分别为100%和72.6%;rhCNTF(R6315)修饰率达90%以上,大多数为单修饰产物,PEG修饰未影响rhCNTF(R^6315)的二级结构,修饰位点发生在DLCSR肽段的C17上;P-rh CNTF(R^6315)经皮下及静脉途径给药的血药浓度均在注射后约72 h降至给药前水平。与赋形剂组比较,P-rhCNTF(R^6315)0. 05、0.1、0.2 mg/kg剂量组小鼠在疗程结束时体重组分别减轻了10%、11%和21%(P <0.05),rh CNTF(R^6315)组减轻了30%(P<0.01);治疗后15 d,rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315)各剂量组小鼠摄食量明显降低(P<0.05),随后逐渐恢复正常水平;P-rhCNTF(R^6315)各剂量组从给药后8 d起,小鼠随机血糖有所降低,呈一定的量效关系,rhCNTF(R^6315)组从给药后4 d开始有所下降;P-rh CNTF(R^6315) 0.2 mg/kg剂量组和rhCNTF(R^6315)组的口服糖耐量(oral glucose resistant test,OGTT)曲线下面积(AUC0~2 h)及腹腔内脂肪重量显著降低(P<0.05),rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315)各剂量组小鼠皮下脂肪均显著降低(P<0.01)。结论 制备了较高纯度的rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315),两者对ob/ob肥胖小鼠的体重过高、高血糖症,体脂重量过高均具有良好的疗效,且P-rhCNTF(R^6315)更长效。

重组人睫状神经营养因子突变体及其长效分子对饮食诱导性肥胖伴胰岛素抵抗大鼠的治疗作用

目的探讨重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliaryneurotrophic factor,rhCNTF)突变体rhCNTF(R^6315)及其长效分子P-rhCNTF(R^6315)对饮食诱导性肥胖(diet induced obesity,DIO)伴胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)模型大鼠的治疗作用。方法利用基因工程重组表达技术制备rhCNTF突变体rhCNTF(R^6315)及其长效分子P-rhCNTF(R^6315)。通过饮食诱导建立肥胖伴胰岛素抵抗大鼠模型(DIO-IR),经背部皮下分别注射rhCNTF(R^6315)0.025、0.05及0.1 mg/kg(每天1次)及P-rhCNTF(R^6315)0.025、0.05、0.1、0.2及0.4 mg/kg(每7 d1次),共治疗28 d,评价rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315)对DIO-IR大鼠的治疗作用。结果DIO-IR大鼠治疗28 d后,rhCNTF(R^6315)0.1 mg/kg剂量组高血清胰岛素水平显著改善(P均<0.01),0.05、0.1 mg/kg剂量组肝脂肪变性均显著改善(P均<0.01);P-rhCNTF(R^6315)0.2、0.4 mg/kg剂量组高血清胰岛素水平显著改善(P均<0.01),并恢复至正常水平,口服糖耐量无明显变化(P>0.05),0.1、0.2、0.4 mg/kg剂量组高血清瘦素水平显著改善(P均<0.05),同时总胆固醇水平显著改善(P均<0.05),所有治疗剂量组肝脂肪变性均显著改善(P均<0.05)。结论rhCNTF突变体rhCNTF(R^6315)及其长效分子P-rhCNTF(R^6315)对DIO-IR大鼠的胰岛素抵抗、高瘦素血症、高胆固醇血症及肝脂肪变性均有显著的治疗效果,其中P-rhCNTF(R^6315)发挥了长效作用。

睫状神经营养因子对脊髓神经元的保护作用

目的 :研究脊髓损伤后脊髓神经元内酶学的变化 ,并探索睫状神经营养因子 (CNTF)对神经元的保护作用。 方法 :用 Allen改良法打击模型致 SD大鼠 T8脊髓损伤 ,分别于术前及术后 3,7,10 d测定脊髓组织内乙酰胆碱酯酶 (ACh E)和酸性磷酸酶 (ACP)的含量。结果 :ACh E于术后持续下降 ;ACP在术后第 3天开始上升 ,第 7天升至最高 ,以后逐渐下降 ;用 CNTF处理的大鼠上述两种酶变化的幅度较小 ,且整个过程也比较平稳。 结论

电针对大鼠坐骨神经损伤后脊髓运动神经元睫状神经营养因子水平的影响

目的:探讨电针对大鼠坐骨神经损伤后脊髓运动神经元睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)的影响。方法:取Wistar大鼠56只,行左侧坐骨神经切断外膜缝合。电针组每天穴位电针20min,模型组不作任何处理。分别于术后7,14,21和28d测定脊髓前角CNTF阳性神经元计数、神经元平均积分光密度及4周时损伤神经电生理。结果:坐骨神经损伤后损伤脊髓前角CNTF阳性神经元数量明显少于正常对照组,电针组损伤侧脊髓前角内CNTF阳性神经元数量在各时间点明显高于模型组(P<0.05),14d时电针组伤侧脊髓前角内CNTF阳性神经元数量为(53±11)个,模型组为(29±9)个。同时模型组神经元内CNTF阳性神经元平均积分光密度在各时间点与正常组比较明显降低,在14d最低为273.2±33.7。而电针组CNTF在各个时间点明显高于模型组(P<0.05);28d康复组神经肌肉动作电位、运动神经传导速度均优于模型组(P<0.01)。结论:电针可提高损伤神经神经元内源性CNTF水平,减少神经元变性、死亡,促进神经电生理的恢复。

重组人睫状神经营养因子对糖尿病大鼠胃肠功能的影响

目的评价重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)对糖尿病大鼠胃肠道功能的作用。方法采用链脲佐菌素(strepto- zocin,STZ)诱发的糖尿病大鼠胃肠神经功能紊乱模型,肌注rhCNTF 0.1,0.3,0.9mg·kg^(-1),测定了rhCNTF对血糖、胃肠慢波电位、小肠壁内神经蛋白含量,观察了rhCNTF对胃肠推进功能的影响以及胃肠对乙酰胆碱(Ach)、阿托品敏感性的影响。结果肌内注射rhCNTF对血糖无明显影响,也未见rhCNTF改善十二指肠对Ach、阿托品的敏感性。肌注RhC- NTF可改善糖尿病大鼠胃肠慢波电位、提高了胃肠推进功能、增加了胃肠壁内神经蛋白含量。结论糖尿病导致的胃肠神经功能紊乱可以通过肌注rhCNTF而改善,其重要机制是rhCNTF对抗糖尿病引起的胃肠神经病变。

人睫状神经营养因子基因克隆、表达、纯化及其生物活性

［摘 要］目的 克隆人睫状神经营养因子（hCNTF）基因，在大肠杆菌宿主系统中高效表达并纯化，获得具有生物活性的hCNTF蛋白。方法 以人染色体DNA为模板，经PCR扩增到编码CNTF成熟蛋白的cDNA序列，并克隆进原核表达载体 pBV220，在大肠杆菌 BL21（Gold）中进行表达，产物经 CM-Sepharose FF柱纯化后，以体外培养的鸡胚背根神经节（DRG）测定生物活性。结果 重组表达质粒pBV22Z- CNTF在大肠杆菌BL21（Gold）中获得了非融合的稳定、高效表达，目的蛋白占细胞总蛋白的45％左右，以可溶性和包涵体两种形式存在，表达上清及包涵体复性后经CM柱一步纯化纯度达90％以上；表达的重组hCNTF能促进培养的鸡胚背根神经节神经突起的生长。结论 基因工程rhCNTF的获得为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定基础。

人睫状神经营养因子结构和功能的研究

目的：制备高活性的重组人睫状神经营养因子（ｈＣＮＴＦ），并研究其生物学功能。方法：应用大肠杆菌表达ｈＣＮＴＦ，用片段插入和缺失法研究其结构与功能关系；切断大鼠坐骨神经，局部及皮下给予ＣＮＴＦ，应用辣根过氧化物酶逆行追踪技术显示再生轴突通过修复部位的胞体。结果：ｈＣＮＴＦ分子中α－螺旋结构的维持对其生物活性十分重要，Ｃ端松散结构对其生物活性贡献不大，Ｄ螺旋中后段可能与生物活性有密切关系；与对照组相比，ＣＮＴＦ组脊髓标记胞体显著增加。结论：本研究为获得高活性、低副作用的ＣＮＴＦ提供了理论依据；所获ｈＣＮＴＦ能明显促进周围神经运动轴突的再生。

重组睫状神经营养因子对周围神经再生中多种细胞的作用

为了解重组睫状神经营养因子 ( CNTF)对周围神经再生中多种细胞的作用 ,用硅管套接切断的成年大鼠坐骨神经 ,在受损神经局部一次性给予重组睫状神经营养因子 :用免疫组织化学 ABC法结合计算机图像分析观测再生神经中 GAP-4 3、S10 0、CD68、MHC- 免疫反应阳性物质的变化。与生理盐水对照组相比 ,证明 CNTF组再生神经中上述四种物质显著增多。结果提示重组睫状神经营养因子能促进轴突的再生、Schwann细胞的迁入。