CAR siRNA对睾丸支持细胞上皮屏障通透性的影响及机制

目的观察柯萨奇病毒—腺病毒受体(CAR)siRNA对睾丸支持细胞上皮屏障通透性的影响,并探讨其机制。方法采用睾丸支持细胞原代双室培养方法制备睾丸支持细胞上皮屏障,细胞培养3 d后分为CAR siRNA组、对照组,分别转染CAR siRNA、无同源性非靶向双链RNA。转染后第2天,分别采用RT-PCR和Western blotting法检测睾丸支持细胞中CAR mRNA、蛋白表达;采用Millicell-ERS电阻系统测量双室模型内外室的电位差;采用免疫荧光细胞化学染色法检测支持细胞的Occludin蛋白,荧光显微镜下观察Occludin分布情况;采用Western blotting法检测支持细胞中总Occludin蛋白量、与早期内涵体抗原1(EEA1)抗体结合的Occludin蛋白。结果 CAR siRNA组与对照组CAR mRNA相对表达量分别为0.122±0.013、0.429±0.039,CAR蛋白相对表达量分别为0.142±0.041、0.532±0.022,两组比较,P均<0.05。CAR siRNA组与对照组TER分别为(37±2.5)、(50±3.0)ohm·cm2,两组比较,P<0.05。CAR siRNA组与对照组Occludin蛋白相对表达量分别为0.164±0.025、0.143±0.031,两组比较,P>0.05。对照组Occludin呈蜂巢样沿细胞膜线状分布;CAR siRNA组Occludin分布较紊乱,细胞膜处减少,线性分布破坏,细胞质内增多。CAR siRNA组、对照组细胞中与EEA1结合的Occludin蛋白量分别为1.332±0.018、1.000±0.015,两组比较,P<0.05。结论 CAR siRNA能增加睾丸支持细胞上皮屏障通透性,其机制可能与其诱导Occludin蛋白内吞增强而分布改变有关。

微囊藻毒素亮氨酸精氨酸(MC-LR)损伤睾丸支持细胞免疫反应及细胞生物学行为的机制研究进展

微囊藻毒素亮氨酸精氨酸(MC-LR)是水华爆发时微囊藻属、鱼腥藻属等蓝藻产生的一种对人类有致癌性的藻毒素。MC-LR可对雄性动物生殖系统产生毒性,导致不育,主要表现为诱导细胞凋亡、破坏细胞骨架、干扰DNA损伤修复途径或损伤血睾屏障(BTB)功能等。睾丸支持细胞(Sertoli细胞)是生精小管中与生精细胞直接接触的体细胞,可通过分泌多种细胞因子和免疫抑制因子调节免疫反应以维持睾丸免疫稳态,亦可与邻近生殖细胞形成BTB,为各级生精细胞提供营养、支持和保护作用的微环境。MC-LR可引发睾丸Sertoli细胞炎症、诱导细胞凋亡、破坏BTB完整性,进而造成睾丸生精功能障碍。

睾丸支持细胞发育与血睾屏障形成的微观结构

为探明睾丸发育过程中支持细胞发育和血睾屏障形成的形态学变化,以期为猪血睾屏障和雄性生殖细胞的研究和应用提供理论依据,试验选取7,30,60,70,90,110日龄的民猪睾丸,制做光镜和电镜的组织学切片,并对切片进行免疫荧光染色。结果表明:民猪7日龄时支持细胞生长在曲细精管管壁内的基膜上。随着日龄的增加,生殖细胞向基膜迁移,将支持细胞推向管腔中心侧。民猪60日龄时生殖细胞和支持细胞镶嵌排列,支持细胞的细胞质特别发达,细胞质相连,开始形成血睾屏障。民猪70日龄时管腔中央充满支持细胞的细胞质,细胞质相连。90日龄时支持细胞的细胞质内附着大量的初级精母细胞和精细胞,生殖细胞之间存在支持细胞的连接。民猪110日龄时管腔内出现变形的精子。说明民猪支持细胞血睾屏障的形成在60~90日龄之间,90日龄之后血睾屏障已经具备了完整的功能,能够支持精子发生。

D-半乳糖(D-gal)通过激活p38MAPK通路引起小鼠睾丸TM4支持细胞屏障功能损伤

目的研究D-半乳糖(D-gal)对小鼠TM4睾丸支持细胞屏障功能的损伤作用及机制。方法TM4细胞分为正常对照组和(25、50、100、150、200、250)mmol/L D-gal刺激组,噻唑蓝(MTT)法检测TM4细胞增殖活性,Western blot法检测TM4细胞紧密连接相关蛋白闭锁小带蛋白1(ZO-1)和闭合蛋白(occludin),黏附连接相关蛋白神经钙黏蛋白(N-cadherin)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)和β联蛋白(β-catenin),缝隙连接相关蛋白连接子蛋白43(CX43),骨架蛋白波形蛋白(vimentin)和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路相关蛋白胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、Janus激酶(JNK)和p38MAPK的蛋白表达及磷酸化水平。结果与正常对照组比较,D-gal浓度大于50 mmol/L时,细胞活力显著下降;ZO-1、occludin、N-cadherin、E-cadherin和β-catenin的蛋白表达水平均显著降低,p38MAPK蛋白磷酸化水平显著增加,而CX43、vimentin及ERK1/2、JNK蛋白及磷酸化水平无明显变化。结论D-gal可引起TM4睾丸支持细胞紧密连接损伤和黏附连接损伤,可能与激活p38MAPK通路有关。

基因芯片技术在睾丸支持细胞方面的应用进展

当前,基因芯片技术凭借其高通量、高敏感度、高度自动化和高效快速等特点,在不同领域得到了广泛应用和迅速发展。就男性不育的研究中,芯片技术可以直接快速、精准的反映与精子发生等相关的差异表达基因,并进一步利用QT-PCR、Western blot、RNAi等技术进行深入研究,取得了很多突破性进展。以往研究证实睾丸支持细胞的结构和功能与精子发生关系密切,故本文主要综述基因芯片技术在睾丸支持细胞方面的研究现状进展,并试图利用基因芯片技术探索睾丸支持细胞在不同情况下的基因改变,找出影响精子发生的关键基因或信号通路,为临床或基础在男性不育方面的研究提供新的靶向和依据。

电磁脉冲辐射对小鼠睾丸血-睾屏障的影响

采用常规苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining,HE staining)、硝酸镧示踪电镜和埃文思兰 (Evans Blue,EB)尾静脉注射三种方法,综合观察100kV／m和400kV／m两种不同强度电磁脉冲辐射对小 鼠睾丸血-睾屏障的影响。三种方法观察结果基本一致,两种强度的电磁脉冲辐射均可造成小鼠睾丸支持细胞和 血一睾屏障不同程度的损伤,400 kV/m辐射组损伤更甚,辐射后1 d即可见大量生精细胞的凋亡与坏死,支持细 胞亦发生形态结构的变化,血-睾屏障严重损伤,随后大量第Ⅷ期生精小管内出现基底室与近腔室的分离,大量 凋亡与坏死的生精细胞向管腔的排放,至辐射后21d仍可见到血-睾屏障损伤;100kV/m辐射组的损伤较 400 kV/m辐射组稍轻,辐射后14 d支持细胞、生精上皮以及血-睾屏障的损伤已基本恢复。结果提示一定强度 的电磁脉冲可以造成小鼠血-睾屏障的损伤,这种损伤呈辐射强度依赖性,并且与损伤后恢复时间相适应。

Rictor/mTORC2调节小鼠睾丸血睾屏障与精子发生

目的研究Rictor/m TORC2在睾丸血睾屏障形成、睾丸发育和精子发生中的作用及相关机制。方法采用Cre-lox P重组酶系统,构建睾丸支持细胞中rictor基因敲除小鼠。比较敲除鼠和对照鼠的生殖器官外观和质量。HE染色观察睾丸和附睾的组织形态。采用流式细胞技术检测生精小管的细胞周期。采用免疫荧光技术检测增殖蛋白(Ki-67)和分离酶蛋白的表达。采用免疫组化和Western blot技术检测血睾屏障相关蛋白表达。结果相比对照鼠,敲除鼠的睾丸和附睾体积和重量都明显变小(P<0.01);敲除鼠的生精细胞中二倍体细胞显著上升(P<0.01),单倍体细胞显著下降(P<0.01),而四倍体细胞、Ki-67和分离酶蛋白无显著差异;血睾屏障相关蛋白出现严重的位置错乱,而蛋白表达量不受影响。结论睾丸支持细胞中rictor基因的正常表达,在血睾屏障结构完整性维持和功能发挥以及精子正常发生中起着至关重要作用。

淫羊藿苷通过激活ATF6/c-fos信号通路改善自然衰老大鼠睾丸支持细胞功能减退的研究

目的探究淫羊藿苷对自然衰老大鼠睾丸支持细胞(Sertoli细胞)功能减退的改善作用及可能的作用机制。方法将SPF级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠按体重随机分成青年对照组(2月龄)、衰老模型组(17月龄)、淫羊藿苷低和高剂量组(2、6 mg·kg^(-1),17月龄),各组大鼠分别给予普通饲料或含药饲料持续喂养4个月。苏木素-伊红(HE)染色法观察各组大鼠睾丸组织形态学改变。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组大鼠睾丸组织闭锁小带蛋白1(ZO-1)、闭锁蛋白(occludin)、β-连环蛋白(β-catenin)、早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF)、骨形成蛋白4(BMP4)、激活转录因子6(ATF6)和c-fos的蛋白表达和定位。结果HE染色结果发现,淫羊藿苷可明显改善自然衰老大鼠睾丸组织形态学变化。Western blot结果显示,与青年对照组相比,衰老模型组大鼠睾丸组织中ZO-1、occludin、β-catenin、PLZF和BMP4蛋白表达水平均显著下降,而淫羊藿苷可显著上调衰老大鼠睾丸组织中上述蛋白的表达水平。免疫荧光结果显示,与衰老模型组相比,淫羊藿苷能明显上调衰老大鼠睾丸Sertoli细胞中occludin和β-catenin以及通路相关指标ATF6和c-fos蛋白表达水平。结论淫羊藿苷可减轻衰老所致大鼠睾丸Sertoli细胞功能减退,机制可能与激活Sertoli细胞ATF6/c-fos信号通路有关。

氧化镉对青春前期雄性大鼠睾丸自噬水平和血睾屏障完整性的影响

目的以氯化镉(CdCl2)染毒青春前期雄性SD大鼠和睾丸支持细胞(TM4细胞),研究镉暴露对睾丸自噬水平和血睾屏障完整性的影响。方法于2021年7月,将9只4周龄雄性SD大鼠随机分为3组:对照组(生理盐水)、低剂量组(1 mg/kg体重CdCl2溶液)、高剂量组(2 mg/kg体重CdCl2溶液),采用腹腔注射的方式进行染毒。24 h后采用HE染色法观察大鼠睾丸组织形态学变化,生物示踪法观察血睾屏障的完整性,并检测睾丸组织中微管相关蛋白轻链3(LC3)-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表达水平。0、2.5、5.0和10.0 μmol/L CdCl2溶液处理TM4细胞24 h检测镉的毒作用,将细胞分为空白组(未染毒)、染毒组(10 μmol/L CdCl2)、实验组[10 μmol/L CdCl2+60 μmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)]和抑制剂组(60 μmol/L 3-MA),处理24 h后,Western blot分析LC3-Ⅱ、泛素结合蛋白p62、紧密连接蛋白ZO-1和黏附连接蛋白N-cadherin的表达情况。结果高剂量组大鼠睾丸组织形态结构发生明显变化,曲细精管分布不均匀,形态不规则,生精上皮变薄,结构疏松,细胞排列紊乱,细胞核异常深染,支持细胞出现空泡;生物示踪法结果显示低剂量组和高剂量组大鼠血睾屏障完整性受到破坏;Western blot结果发现与对照组比较,低、高剂量组大鼠睾丸组织中LC3-Ⅱ表达水平升高,差异有统计意义(P<0.05)。与0 μmol/L比较,5.0、10.0 μmol/L CdCl2染毒后,TM4细胞中ZO-1和N-cadherin表达水平明显下降,p62表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与染毒组比较,实验组TM4细胞p62表达水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显下降,ZO-1和N-cadherin相对表达量明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论镉对雄性SD大鼠生殖系统的毒性作用机制可能与影响睾丸组织细胞自噬水平和破坏血睾屏障完整性有关。

褪黑素对LPS诱导的犊牛睾丸支持细胞氧化应激和凋亡的影响

为了探究犊牛睾丸支持细胞(SCs)在血睾屏障形成过程中受到细菌感染的影响以及褪黑素的缓解作用。本试验使用CCK-8试剂盒测定SCs活力,活性氧(ROS)试剂盒、谷胱甘肽(GSH)试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒分别测量ROS、GSH的表达和SOD活性,Western blot和RT-PCR分析Nfr2、HO-1、p53、Caspase3和Connexin43表达量。结果表明,5 mg/L LPS可以激活Nfr2/HO-1信号通路和p53信号转导,从而显著上调ROS和Caspase3的表达量,显著下调SOD和GSH的活性和表达,造成SCs氧化应激和细胞凋亡,进而下调Connexin43蛋白的表达,降低细胞活力。加入50μmol/L褪黑素后,可以显著抑制激活Nfr2/HO-1信号通路和p53信号转导,从而显著下调ROS和Caspase3的表达量,显著上调SOD和GSH的活性和表达,缓解LPS造成SCs氧化应激和细胞凋亡,进而恢复Connexin43蛋白的表达和细胞活力。结果说明,褪黑素可以缓解LPS诱导SCs的氧化应激和细胞凋亡,对Connexin43蛋白表达有保护作用。

Adjudin抑制人精子获能和受精能力及其作用机制

背景：Adjudin系Lonidamine衍生物。以往我们在大鼠、家兔及猎犬研究证明Adjudin是一种潜在的男性避孕药，它通过干扰睾丸支持细胞和生精细胞的粘附连接，由此引起成熟前生精上皮精子细胞释放，导致雄性不育（MrukandCheng，2011）。然而，Adjudin是否干扰人精子的受精能力及其可能的作用机制，至今尚未研究。

睾丸Sertoli细胞功能研究的新进展

睾丸支持细胞又称Sertoli细胞，在生精小管内数量恒定，相邻Sertoli细胞间形成紧密连接，组成血睾屏障，并由此将生精上皮分隔成基底室和近腔室。Sertoli细胞直接接触生精细胞，且对其周边微环境的调控意义重大。除了其最基础的支持与营养功能外，

睾丸免疫豁免机制的研究进展

精子的产生、分化的过程是在机体的免疫系统成熟之后,却并未引起机体的免疫排斥反应,这种独特的自我免疫耐受现象的出现是对机体免疫系统的一种挑战。最初,人们观察到某些染料不能被睾丸生精上皮细胞吸收。

精浆转铁蛋白与曲细精管功能

睾丸曲细精管的生殖上皮由生精细胞和支持细胞(sertoli细胞)组成。支持细胞构成血睾屏障,对生精细胞有支持和营养作用,并参与精子的形成和排放过程,因此支持细胞功能在一定程度上反映曲细精管的功能。过去,曲细精管的功能主要通过测定FSH水平或精液常规分析等指标进行评估。