一种新的睾丸特异核孔蛋白基因特性的研究

目的通过筛选人睾丸特异基因及对其结构和功能的研究，为阐明精子发生与成熟提供新的线索。方法采用筛选人睾丸表达文库、快速扩增ｃＤＮＡ５′末端、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析、荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）以及基因重组等技术。结果（１）获得一新的长度为２２０９ｂｐ的ｃＤＮＡ，编码７００个氨基酸，将该基因命名为ＢＳ－６３。Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ注册号为Ｕ６４６７５。（２）ＢＳ－６３Ｎ端具有核孔蛋白的特征性结构元件“ＸＦＸＦＧ”或“ＦＧ”以及与Ｒａｓ相关核蛋白（Ｒａｎ）结合的典型特征。（３）Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析显示，ＢＳ－６３基因有６．０和８．５ｋｂ两种转录形式，其中６．０ｋｂ为睾丸组织特异性转录本。（４）ＦＩＳＨ显示，ＢＳ－６３基因定位于２ｑ１１．２～１２。（５）ＢＳ－６３ｃＤＮＡ在大肠杆菌中获得高效表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示，表达蛋白的相对分子质量约为８００００。（６）体外功能实验表明，该表达蛋白可被蛋白激酶Ｃ及细胞周期依赖性蛋白激酶Ⅱ磷酸化。结论ＢＳ－６３可能是一种新的睾丸特异核孔蛋白。

人睾丸组织特异表达新基因HSD-9的克隆及其编码蛋白质功能

目的利用本室建立的人睾丸组织中不同细胞特异表达的ESTs文库克隆新基因HSD-9,初步研究HSD-9蛋白的特性及功能。方法采用电子克隆手段获得新基因HSD-9,生物信息学手段分析基因及编码蛋白质的特点,Northern blot研究HSD-9基因的表达谱,原核表达方法得到HSD-9蛋白并制备特异性多克隆抗体,免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术研究HSD-9蛋白在生精细胞中的定位及在哺乳动物细胞中的表达特点。结果HSD-9基因在人睾丸组织特异表达,其大鼠同源物可在大鼠各级生精细胞中表达;HSD-9-EGFP在CHO细胞和S4细胞中表达呈现沿细胞膜分布的小颗粒和偏心分布于胞内一侧的粗大颗粒;HSD-9-EGFP和网格蛋白clathrin可以部分共定位。结论HSD-9是人睾丸组织特异表达新基因,其编码蛋白质在CHO细胞和S4细胞中表达特点非常类似于内吞小体蛋白的表达特点,推测其可能参与了细胞中内吞过程的调节。

小鼠睾丸组织特异基因RNA干扰载体的构建及其表达的研究

目的构建并筛选小鼠睾丸组织特异基因Fank1干扰载体,为进一步研究Fank1基因功能及与Fank1基因相关男性不育的基因治疗奠定基础。方法根据Fank1基因cDNA序列,利用http://www.dharmacon.com/在线设计软件设计2条干扰序列,分别克隆至带有H1启动子的质粒载体pSuper-neo-GFP中,同时从成年B6小鼠睾丸组织扩增Fank1基因全序列,构建Fank1基因与红色荧光蛋白表达融合载体pdsRED-Fank1。采用脂质体法将2个Fank1基因干扰载体及阴性对照分别与Fank1基因表达载体共转染293T细胞,并观察siRNA对Fank1基因的抑制效应及红色荧光蛋白表达情况,分别采用RT-PCR和Western blot方法检测mRNA及蛋白质表达水平。结果经PCR检测鉴定,含干扰序列的重组质粒pSuper-sh Fank1631#,pSuper-shFank1247#及pdsRED-Fank1表达载体构建成功,测序分析完全正确。转染293T细胞36h后,荧光显微镜检查发现shFank1631、247均能明显抑制红色荧光蛋白表达,抑制效率分别为95%和90%,RT-PCR和Western blot结果表明Fank1基因在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制(P<0.05)。结论成功构建出小鼠睾丸特异基因干扰载体,为制备Fank1基因敲减转基因小鼠及研究Fank1基因在精子生成过程中的作用奠定了基础。

ubiquilin3基因在小鼠组织中的表达及意义

目的探讨ubiquilin3基因在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、小肠、大肠、睾丸、卵巢、子宫等多种组织及不同周龄小鼠睾丸组织的表达及其意义。方法分别利用PCR、Western、Northern等方法,观察ubiquilin3基因在小鼠多种组织、不同周龄的小鼠睾丸组织,mRNA和蛋白水平的表达。结果在mRNA和蛋白水平上,ubiquilin3基因在其他组织中均没有表达,而在小鼠睾丸组织中特异性表达;在不同周龄的小鼠睾丸组织中,从2周龄的小鼠睾丸组织开始表达,3周表达量逐渐增加,至4周小鼠中表达量达最高,且在成熟小鼠中持续表达。结论 ubiquilin3基因在小鼠睾丸组织特异表达,在成熟小鼠中表达量达到最高值,推测其与小鼠精子生成及精子成熟过程相关。

TSPYL基因家族的研究进展

类Y染色体编码睾丸特异蛋白基因家族(Testis-specific protein Y encoded-like,TSPYL)编码一类具有参与核小体装配,维持细胞活力状态功能的蛋白。这些蛋白在人体内分部广泛,并参与机体的多种生理病理过程。近期研究表明该类基因的变异及其表观遗传学调控与某些发育性疾病和肿瘤的发生发展有较为密切的关系。通过研究TSPYL类基因的生物学特性和功能,以及与其相关疾病的关系,可为今后的基因靶向治疗提供新的方向和策略。

睾丸特异表达基因-1在小鼠隐睾模型中的表达及其意义

目的 探讨睾丸特异表达基因-1（TSEG-1）在小鼠隐睾模型中的定位、定量表达变化及其意义.方法 将46只雄性昆明新生小鼠随机分为对照组（n=10）、丙二醇（溶剂）注射组（n=15）、17β-雌二醇注射组（n=21）,应用苏术素-伊红（HE）染色观察睾丸组织形态学改变,原位杂交、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和实时定量PCR检测TSEG-1 mRNA的定位和定量变化.结果 17β-雌二醇注射组发生隐睾,而对照组和丙二醇注射组睾丸位置正常.与对照组比较,17β-雌二醇组睾丸组织80%曲精小管管腔消失,Ⅰ～Ⅳ级生精细胞数目减少,60%精母细胞或精子细胞核皱缩,90%精子发生障碍.在对照组睾丸组织中,TSEG-1 mRNA表达水平是模型组25倍,主要定位于精母细胞和早期精子细胞,而隐睾组TSEG-1 mRNA表达水平显著下调.结论 17β-雌二醇诱导小鼠隐睾模型是制作隐睾模型的有效方法 ,新基因TSEG-1可能参与雌激素诱导隐睾模型的发生过程.

睾丸特异表达基因-1在乙醇致小鼠睾丸损伤模型中的表达及意义

目的 探讨睾丸特异表达基因-1（TSEG-1）在乙醇致小鼠睾丸损伤模型中的表达变化及意义。方法 首先建立乙醇致睾丸损伤模型,将12只雄性昆明小鼠随机分为对照组和实验组,每组6只,用生理盐水稀释无水乙醇为15%浓度。实验组小鼠每天按3 g乙醇（15%,V/V）/kg体质量,腹腔内注射14 d,对照组为等体积生理盐水。应用苏木素-伊红（HE）染色鉴定睾丸组织形态学变化,实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测TSEG-1 mRNA变化,采用免疫组织化学和Western blot检测其蛋白变化。结果 乙醇组睾丸HE染色结果提示,与对照组比较,乙醇组睾丸组织85.6%曲精小管管腔消失,I-Ⅳ级生精细胞数目减少,78.2%精母细胞或精子细胞核皱缩。在乙醇组睾丸组织中,TSEG-1 mRNA表达水平（7.500±0.657,n=6）较对照组（0.985±0.231,n=6）显著增加,差异有统计学意义（t=22.915,P〈0.01）。同时,乙醇组TSEG-1蛋白质较生理盐水组显著增加,经Quantity One软件分析灰度值后,与管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）比较,乙醇组TSEG-1蛋白（1.360±0.202,n=6）较生理盐水组（0.330±0.112,n=6）表达增加达4倍,差异有统计学意义（t=10.69,P〈0.01）。结论 乙醇致小鼠睾丸损伤模型是研究睾丸损伤的可靠模型,TSEG-1可能参与乙醇致睾丸损伤模型的分子发生过程。

TSEG-2基因在小鼠睾丸扭转复位模型中的表达特征

目的 探讨睾丸特异表达基因2（testis specific expressed gene 2,TSEG-2）在小鼠睾丸扭转复位模型中的表达特征.方法 昆明小鼠36只,随机分组为对照组（6只）、假手术组（6只）、单侧睾丸扭转复位实验组（24只）.实验组分为2组,每组12只,左侧睾丸扭转720°维持2 h,分别于复位后1、7 d取扭转侧睾丸.采用HE染色、原位末端标记技术（TUNEL）观察睾丸组织形态改变;黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸比色法测定超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）活性;原位杂交法观测TSEG-2在睾丸生精细胞内的表达定位;实时定量PCR法检测TSEG-2基因在睾丸组织中的表达水平.结果 对照组和假手术组生精上皮排列规则,扭转复位后1、7 d的睾丸组织内生精上皮结构松散,出现生精细胞凋亡,Johnsen＇s评分分别降低23.4%、64.1%（P〈0.01）,SOD活性降低11.6%、22.2%（P〈0.05）,MDA活性升高69.6%、93.2%（P〈0.01）.TSEG-2基因表达定位于小鼠睾丸生精小管的精原细胞和精母细胞.与对照组比较,扭转复位1、7 d后睾丸组织内TSEG-2表达水平分别上调2.2倍、6.6倍（P〈0.01）.结论 成功建立小鼠睾丸扭转复位模型,TSEG-2表达上调可能与抗氧化酶活性下降、生精细胞凋亡有关.

TSEG-2基因真核表达载体的构建及其在细胞内的表达

目的构建睾丸特异表达基因2（TSEG-2）的真核表达载体，探讨TSEG-2存细胞中的表达及其生物学功能。方法以小鼠睾丸组织cDNA为模版，设计携带HindⅢ和BamHI酶切位点的引物序列，聚合酶链反应（PCR）扩增基因片段，克隆至携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的真核表达载体pEGFP—N1；在阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）的介导下，重组质粒转染体外培养的精母细胞株GC-2spd48h后，荧光显微镜下观察TSEG-2基因在细胞内的表达定位，噻唑蓝（MTT）比色法测定细胞生长活性，AO／EB荧光染色法、Hoechst33258荧光染色法、AnnexinV—FITC／PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，实时定量PCR测定Fas、bcl-2、bax表达水平。结果成功构建了TSEG-2与EGFP的融合表达载体pEGFP—TSEG2，转染GC-2spd细胞后可见胞质内绿色荧光蛋白表达。转染pEGFP—TSEG248h后，GC-2spd细胞生长抑制39．2％（P〈0．05），出现细胞凋亡形态学改变，凋亡率为28．3％（P〈0．05）；GC-2spd细胞中Fas和bcl-2的表达分别下调17．9％、64．8％（P〈0．05），而bax的表达上调25．1％（P〈0．05）。结论成功构建TSEG-2基因的真核表达载体，能在精母细胞株中表达并促进细胞凋亡。